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申请/专利权人：复旦大学

摘要：本发明属于生物工程技术领域，具体为一种高效合成肌醇的马克斯克鲁维酵母工程菌及其应用。本发明的高效合成肌醇的马克斯克鲁维酵母工程菌，是在马克斯克鲁维酵母FIM1Δura3菌株中依次敲除葡萄糖‑6‑磷酸异构酶PGI基因、葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶ZWF1基因、肌醇加氧酶MIOX5基因以及肌醇转运蛋白ITR2基因，然后转入共表达布氏锥虫肌醇磷酸合酶TbIPS基因和大肠杆菌肌醇单磷酸酶EcIMP基因的载体pUKDN115‑Pinu‑EcIMP‑Ttef‑Ptef‑TbIPS‑Tinu所获得。本发明还公开高效制备肌醇的方法，即以所述马克斯克鲁维酵母工程菌株为发酵菌株，以葡萄糖、甘油、酵母提取物、蛋白胨等成分为培养基，经培养发酵产生肌醇，上清中肌醇产量可达到80.65gL。

主权项：1.一种高效合成肌醇的马克斯克鲁维酵母代谢工程菌株，其特征在于，由如下步骤构建得到：1利用Crispr基因编辑技术，在马克斯克鲁维酵母FIM1Δura3菌株，敲除基因组的葡萄糖-6-磷酸异构酶PGI基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶ZWF1基因，构建获得马克斯克鲁维酵母菌株，记为FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1；2在马克斯克鲁维酵母菌株FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1中敲除肌醇加氧酶MIOX5基因，构建得到马克斯克鲁维酵母底盘菌株，记为FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1Δmiox5；3在马克斯克鲁维酵母底盘菌株FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1Δmiox5中敲除肌醇转运蛋白ITR2基因，构建获得马克斯克鲁维酵母底盘菌株，记为FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1Δmiox5Δitr2；4用菊粉酶启动子Pinu和TEF终止子Ttef，构建布氏锥虫Trypanosomabrucei肌醇磷酸合酶TbIPS基因表达框；用TEF启动子Ptef和菊粉酶终止子Tinu构建大肠杆菌Escherichiacoli基因肌醇单磷酸酶EcIMP基因表达框；将TbIPS基因表达框和EcIMP基因表达框依次插入到一个马克斯克鲁维酵母表达载体pUKDN115上，构建获得肌醇磷酸合酶TbIPS和肌醇单磷酸酶EcIMP共表达质粒，记为pUKDN115-Pinu-EcIMP-Ttef-Ptef-TbIPS-Tinu；5将构建获得的表达质粒pUKDN115-Pinu-EcIMP-Ttef-Ptef-TbIPS-Tinu转化至步骤2中所述的马克斯克鲁维酵母菌株FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1Δmiox5或步骤3中所述的马克斯克鲁维酵母菌株FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1Δmiox5Δitr2；筛选分别获得：马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1Δmiox5pUKDN115-Pinu-EcIMP-Ttef-Ptef-TbIPS-Tinu，命名为马克斯克鲁维酵母JC-3；马克斯克鲁维酵母工程菌菌株FIM1Δura3ΔpgiΔzwf1Δmiox5Δitr2pUKDN115-Pinu-EcIMP-Ttef-Ptef-TbIPS-Tinu，命名为马克斯克鲁维酵母JC-4；其中：所述马克斯克鲁维酵母表达载体pUKDN115，含有马克斯克鲁维酵母自主复制序列、菊粉酶启动子、菊粉酶终止子和筛选标记基因URA3元件；所述马克斯克鲁维酵母FIM1Δura3菌株，是将保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心马克斯克鲁维酵母FIM1菌株，保藏号：CGMCCNo.10621，敲除基因组上的尿嘧啶合成酶基因URA3所获得；所述葡萄糖-6-磷酸异构酶PGI基因，Genbank登录号：QGN13438.1；所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶ZWF1基因，Genbank登录号：QGN16990.1；所述肌醇加氧酶MIOX5基因，Genbank登录号：QGN14246.1；所述肌醇转运蛋白ITR2基因，Genbank登录号：QGN17849.1；所述肌醇磷酸合酶TbIPS，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述肌醇单磷酸酶EcIMP，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所述，氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。

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