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申请/专利权人：内蒙古农业大学;内蒙古犇牛科技有限公司

摘要：本发明提供了基于牛全基因组CRISPR‑Cas9敲除文库、敲除细胞库及筛选目标基因的方法，涉及文库构建技术领域。本发明提供了一种牛全基因组编码基因CRISPR‑Cas9文库的构建方法，并基于构建得到的牛全基因组CRISPRCas9敲除文库，首次构建了MDBK牛肾上皮细胞全基因组敲除细胞库。本发明基于牛全基因组CRISPRCas9敲除文库策略，首次筛选并鉴定了9个与β羟丁酸BHBA作用相关的候选基因，可作为药物筛选、标记辅助管理的分子标记或制备基因编辑抗病动物模型的分子靶点。

主权项：1.一种筛选与酮体分子BHBA代谢相关的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库中的MDBK敲除细胞分别用三种培养基进行连续培养，待b组培养基细胞大批量死亡，细胞存活率降至10%，三组细胞全部更换为DMEM完全培养基，待细胞生长至汇合率达80%以上再分别更换为对应的原始培养基进行筛选，收集每组细胞，并提取基因组DNA；所述三种培养基包括a组培养基、b组培养基和c组培养基，其中a组培养基为含FBS和双抗的DMEM完全培养基，b组培养基为含FBS和双抗的DMEM无糖培养基，c组培养基为含FBS、双抗和BHBA的DMEM无糖培养基；所述MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库的构建方法，包括以下步骤：①将MDBK细胞培养至汇合为50%-60%，与经含有DMEM高糖培养基稀释的慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库和聚凝胺混合，培养24h后更换新的DMEM完全培养基继续培养；②病毒库感染细胞3d后，更换Puro培养基筛选培养至7d后，获得MDBK全基因组CRISPR-Cas9敲除细胞库；所述Puro培养基为含有最佳致死浓度的嘌呤霉素的DMEM完全培养基；所述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库的构建方法，包括针对牛的全基因组基因设计并合成sgRNA，以所述sgRNA为模板，利用合成的全基因CRISPR-Cas9sgRNA文库寡核苷酸探针进行扩增，回收扩增产物，得文库扩增产物；在构建所述慢病毒包装的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库时，除看家基因和生存必须基因外，针对全基因组的其余基因，每基因设计4条sgRNA；利用线性化的CRISPR-Cas9文库载体与所述文库扩增产物进行连接，连接后转化Trans1-T1感受态细胞，提取质粒得牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库；（3）利用SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的sgRNA与提取得到的基因组DNA混合进行PCR扩增，回收目的片段后纯化，对纯化产物进行二代测序；（4）将二代测序的数据与构建得到的牛全基因组CRISPR-Cas9sgRNA文库进行比对，进行sgRNA富集数的统计和标准化，筛选得到与酮体分子BHBA代谢相关的基因。

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