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申请/专利权人：华中农业大学

摘要：本发明属于三维基因组技术领域，一种TaDRIM‑seq测序文库的构建方法，该发明将植物或者动物细胞进行交联，提取细胞核，Tn5酶切，通透，离心，RNA打断，PNK处理，RNA连接，反转录，DNA连接，gap补平，二链合成，解交联，纯化，将DNA用Tn5酶切加接头，再用链霉亲和素磁珠孵育，PCR扩增，得到长片段测序文库。本发明首次实现了在完整的核内原位完成抗原‑抗体结合、酶切、连接等步骤，降低了假阳性结果，提高了信噪比；减少了DNA超声打断、末端补平和3’端加A等实验步骤，大大缩短了实验周期、降低了实验复杂性。

主权项：1.一种TaDRIM-seq测序文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：交联植物细胞或动物细胞，交联剂是37％vv的甲醛，所述甲醛的交联浓度是1％vv，交联时间是10N15min；润洗后，用Antibodybuffer重悬，加入抗体，于4℃旋转孵育2h；离心润洗后，用1×Dig-300buffer重悬重悬，加入pGT-Tn5转座酶，于4℃旋转孵育1h；离心用1×Dig-300buffer润洗后，用Tagmentationbuffer重悬，于37℃水浴孵育1h，终止反应后，用0.5％SDS水溶液重悬，在62℃孵育5～10min，然后加入TritonX-100，37℃孵育15min；离心后，用RNAfragmentationbuffer重悬，在37℃孵育3min，冰上孵育5min；离心润洗后，用PNK体系重悬，在37℃孵育1h；离心后，用含有生物素修饰和5’腺苷化的Linker的RNA连接体系重悬；离心润洗后，用反转录体系重悬，在42℃孵育1h；离心后，用DNA连接体系重悬，在16℃孵育24h；离心润洗后，用解交联体系重悬，在65℃、800rpm孵育3h，然后提取DNA沉淀、清洗和溶解DNA；将溶解的DNA在gap补平体系下室温孵育40min，然后磁珠纯化洗脱后，在第二链合成体系下16℃孵育2h，磁珠纯化洗脱；稀释后加入Tn5酶切体系，在55℃孵育10min，磁珠纯化后，用50μLEBbuffer洗脱，再加入2×bindingbuffer得到酶切DNA；对链霉亲和素磁珠进行封闭，将所述酶切DNA和所述封闭的M280磁珠混合，室温孵育45min；清洗后，用ddH2O重悬磁珠，加入PCR体系，进行PCR扩增、片段分选，得到300～500bp的DNA片段测序文库。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 华中农业大学 一种TaDRIM-seq测序文库的构建方法