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申请/专利权人：北京工商大学

摘要：本发明涉及一种化妆品功效添加剂，具体提供一种具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，该组合物中按照重量份数计含有50‑95份银杏叶总内酯、22‑60份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸小于0.0035份，其中银杏叶总内酯选自银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯中的一种或多种，银杏叶总黄酮选自芦丁、槲皮素‑3‑O‑葡萄糖苷、山奈酚‑3‑O‑葡萄糖苷、异鼠李素‑3‑O‑葡萄糖苷和杨梅素中的一种或多种。该组合物可以由单体混合得到，也可以通过对银杏叶提取、分离纯化得到，不同树脂逐级纯化能够有效富集银杏叶中的有效成分，显著提高组合物在延缓细胞衰老方面的效果，可广泛应用于各种化妆品中。

主权项：1.一种具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶组合物由银杏叶总内酯和银杏叶总黄酮组成；所述银杏叶总内酯、银杏叶总黄酮按照重量份数计由以下单体组成：9.7份银杏内酯A、52.1份白果内酯、2份山奈酚-3-O-葡萄糖苷、3份异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和18.1份杨梅素，或12份银杏内酯A、40份白果内酯、4份山奈酚-3-O-葡萄糖苷、4份异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和20份杨梅素，或11份银杏内酯A、6份银杏内酯B、10份银杏内酯C、5份银杏内酯J、46份白果内酯、15份芦丁、6份槲皮素-3-O-葡萄糖苷、3份山奈酚-3-O-葡萄糖苷、2份异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和19份杨梅素，或6.6份银杏内酯B、8.5份银杏内酯C、2.5份银杏内酯J、52.1份白果内酯、16.1份芦丁、4.3份槲皮素-3-O-葡萄糖苷、2份山奈酚-3-O-葡萄糖苷、3份异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和18.1份杨梅素，或9.7份银杏内酯A、6.6份银杏内酯B、8.5份银杏内酯C、2.5份银杏内酯J、52.1份白果内酯、16.1份芦丁、4.3份槲皮素-3-O-葡萄糖苷、3份异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和18.1份杨梅素，或9.7份银杏内酯A、6.6份银杏内酯B、8.5份银杏内酯C、2.5份银杏内酯J、52.1份白果内酯、16.1份芦丁、4.3份槲皮素-3-O-葡萄糖苷、2份山奈酚-3-O-葡萄糖苷和18.1份杨梅素。

全文数据：一种延缓衰老的银杏叶组合物及其制备方法与应用技术领域[0001]本发明属于化妆品添加剂，涉及一种银杏叶组合物及其提取方法与应用，具体涉及一种延缓衰老的银杏叶组合物及其提取方法与应用。背景技术[0002]银杏叶早在3.45亿年前就出现在地球上，是中国特有的第四纪冰川时代孑遗树种。银杏叶70%的资源分布在我国，全世界50多个国家都将银杏叶提取物作为治疗心脑血管疾病的植物原料来源。[0003]银杏叶的化学成分相当复杂。银杏叶中的主要活性成分分为黄酮类成分、银杏内酯类成分和银杏酸三大类。目前已从银杏叶中分离出34余种黄酮类化合物，超过70种黄酮类化合物通过质谱初步鉴定。银杏叶中的主要黄酮苷元为槲皮素，山奈酚，异鼠李素的衍生物和一些以不同连接形式和数量连接的葡萄糖和鼠李糖以及一些由两分子黄酮母核通过C-C键聚合而成的一类双黄酮类化合物。银杏叶中还有一些特征性的内酯类成分包括二萜类内酯化合物和倍半萜类内酯化合物。除此之外，银杏酸是银杏叶提取物中主要的毒性物质，具有致敏性、胚胎毒性、细胞毒性、致突性及免疫毒性。目前，中国药典中EGB生产标准要求把银杏酸的含量控制在IOppm以下，欧洲和美国药典中EGB生产标准要求把银杏酸的含量控制在5ppm以下。[0004]银杏叶作为药食同源的植物，具有多种生物活性，在20世纪60年代就有对银杏叶的药理作用以及实际应用的研究，德国威玛舒培博士药厂研究出的第一个银杏叶提取物EGB761，对心脑血管疾病有很显著的疗效。银杏叶提取物的活性成分有治疗神经系统疾病，降血脂，提高机体免疫力，抗氧化及清除自由基活性等功效，具有较好的药用价值及保健功效。除此之外，EGB还具有抑制金黄色葡萄球、链球菌和真菌的作用。现代药理学研究表明银杏叶提取物具有抗血小板活化因子、抗脑缺血缺氧、降血脂、清除自由基、松弛支气管平滑肌、抗炎及增强神经系统活性等作用，对冠心病、高血压、心绞痛、动脉硬化、脑功能减退、老年性痴呆、记忆减退、衰老等与心脑血管循环有关的疾病有显著的预防和治疗效果。目前，银杏叶提取物已广泛应用于治疗心脑血管疾病的药物中，如专利申请CN103463145A公开了一种以银杏落叶为原料的银杏叶精制提取物，其具有很好的抗氧化，抗血小板聚集及其神经元细胞保护作用，且不良反应低，可作为防治心脑血管疾病的药物与保健食品的主要原料;专利申请CN106420850A公开了银杏叶组合物，该组合物中总黄酮醇苷25-43%，银杏内酯6.5-17%，白果内酯3-5%，银杏酸小于3ppm，在治疗心血管方面的疾病具有良好疗效。[0005]近年来研究表明，银杏叶对皮肤有较好的保护作用，具体体现在抑制UVB辐射及光老化、促进血液微循环、抗氧化和抑制细胞损伤及抗炎和神经保护等方面，在化妆品方面有较大的应用空间。专利申请CN107913204A公开了一种银杏叶护肤乳液，其配方中的原料及重量比分别是:银杏叶提取物10份、硬脂酸单甘酯3份、白矿油3份、辛酸癸酸三甘油酯3份、氢化植物油1份、硬脂酸2.5份、聚丙烯酸树脂10份、山梨糖醇2.5份、丙二醇3份、三乙醇胺0.7份、对羟基苯甲酸甲酯0.2份、香精适量、防腐剂适量、去离子水加至100份。其制备得到的银杏叶护肤乳具有防皱美白、清除自由基等功效。专利申请CN103387896A公开了一种银杏叶美白复合香皂，银杏叶中的黄酮甙、氨基酸合成胶原蛋白成份对人体美容，抑制黑色素生长，保持皮肤光泽与弹性起着不小的作用。以上专利并未关注到银杏叶在抗细胞衰老方面的功效，同时，对于银杏叶提取物的具体成分以及如何抑制细胞衰老并未进行研究，产品的安全性并不能得到保证。[0006]目前，大量研究表明银杏双黄酮可以通过抑制UVB辐射起到光老化保护作用，银杏内酯类成分的主要功效为促进血液微循环、抗氧化、抑制细胞损伤、抗炎和神经保护等。如姜秀新[58]通过研究发现，银杏内酯B能够明显改善老龄机体血小板功能，不仅是血小板活化因子PAF拮抗剂，还具有降低ROS产生的作用。但是，银杏叶提取物的生理作用与其复杂的化学成分有着密切的关系，国内外对于其活性成分的研究主要集中在银杏内酯A，B，J和白果内酯以及银杏双黄酮和异银杏双黄酮，主要的功效研究集中在抑制细胞损伤，抗炎抗氧化，神经保护以及促进血液循环几个方面，但是对于功效成分与活性之间的构效关系并无深入研究。另外，根据国内外对其功效研究的基础，银杏叶作为治疗心脑血管的植物来源，其在延缓衰老方面具有良好的前景，但目前对于其延缓衰老的作用机理并无深入研究。发明内容[0007]基于上述现有技术的缺陷，本发明提供一种具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，通过筛选银杏叶中各种活性成分，明确组合物的组成，使得制备得到的组合物具有良好的延缓衰老的功效，能够抑制MMP-I蛋白表达，促进成纤维细胞CollagenI的表达。[0008]本发明提供一种具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其中含有50-95份银杏叶总内酯、22-60份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸含量小于0.0035份。[0009]进一步地，所述银杏叶组合物含有70-90份银杏叶总内酯、28-45份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸含量小于0.0030份。[0010]更进一步地，所述银杏叶组合物含有72-78份银杏叶总内酯、34-44份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸含量小于0.0028份。[0011]进一步地，所述银杏叶总内酯选自银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯中的一种或多种。[0012]更进一步地，所述银杏叶总内酯按照重量份数计，选自9-15份银杏内酯A、5_10份银杏内酯B、7-12份银杏内酯C、l-8份银杏内酯J和48-55份白果内酯中的一种或多种。[0013]进一步地，所述银杏叶总黄酮选自芦丁、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷和杨梅素中的一种或多种。[0014]更进一步地，所述银杏叶总黄酮按照重量份数计选自12-18份芦丁、3-8份槲皮素-3-0-葡萄糖苷、1-5份山奈酚-3-0-葡萄糖苷、1-5份异鼠李素-3-0-葡萄糖苷和15-24份杨梅素中的一种或多种。[0015]进一步地，所述银杏叶组合物按照重量份数计，包括2-4份山奈酚-3-0-葡萄糖苷、2-4份异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、18-20份杨梅素、10-12份银杏内酯A和48-52份白果内酯。[0016]更进一步地，所述银杏叶组合物按照重量份数计，还包括15-18份芦丁、4-6份槲皮素-3-0-葡萄糖苷、6-9份银杏内酯B、8_l1份银杏内酯C和2-7份银杏内酯J。[0017]本发明的组合物可以通过各单体直接混合制备，也可通过从银杏叶中提取得到。[0018]本发明进一步提供了上述银杏叶组合物的制备方法，包括以下步骤：[0019]1银杏叶干燥后粉碎，加入乙醇超声提取，上清液减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0020]2银杏叶粗提物加水稀释、离心，上清液经大孔吸附树脂进行吸附，乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0021]3银杏叶洗脱液依次用阳离子吸附树脂和大孔吸附树脂进行吸附，乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0022]进一步地，所述银杏叶组合物的制备方法，包括以下步骤：[0023]1银杏叶干燥后粉碎，过80-120目筛，加入12-18倍的90%-100%乙醇超声提取0.5-1.5h，提取2-4次，合并上清液并于40-55°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0024]2银杏叶粗提物加8-12倍水稀释、离心，上清液经DM130大孔吸附树脂进行吸附，55-65%乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0025]3银杏叶洗脱液依次用732阳离子吸附树脂和HPD5000大孔吸附树脂进行吸附，55-65%乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0026]本发明进一步提供上述银杏叶组合物在制备延缓衰老化妆品功效添加剂中的应用。[0027]本发明的有益效果为：[0028]1本发明提供的银杏叶组合物具有良好的抗衰老活性，该组合物可以是由各组分单体混合制备得到，也可以是对银杏叶提取得到的，组合物中山奈酚-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、杨梅素、银杏内酯A和白果内酯均可以显著抑制成纤维细胞MMP-I蛋白的表达，每种组分单独使用均可以起到良好的抗衰老功效，其中银杏内酯A和白果内酯还可以进一步促进成纤维细胞CollagenI蛋白的表达，抗衰老的功效更加明显，如果将这5种组分综合作用，能够协同发挥作用，更加显著地抑制皮肤衰老。银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、芦丁、槲皮素-3-0-葡萄糖苷虽然在抑制成纤维细胞MMP-I蛋白的表达方面没有显著功效，但是其不会影响山奈酸_3-〇_匍萄糖苷、异鼠李素-3-〇-匍萄糖苷、杨梅素、银杏内酯A和白果内酯发挥抗衰老的功效，同时，银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、芦丁、槲皮素ΙΟ-葡萄糖苷的存在，可以通过提高DPPH清除能力等方面进一步促进组合物发挥抗衰老的功效。[0029]2本发明的组合物也可以通过对银杏叶活性成分的提取得到，以乙醇为洗脱剂，分别经过732阳离子吸附树脂和HPD5000大孔吸附树脂，将银杏叶提取物中的活性成分进行了富集，最终得到的银杏叶提取物中含有50-95份银杏叶总内酯、22-60份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸含量小于0.0035份。该工艺提取的到的银杏叶提取物活性成分含量和纯度较高，且制备工艺简单，在抑制成纤维细胞MMP-I蛋白的表达和促进CollagenI蛋白的表达方面功效显著，能够广泛应用于化妆品中，提高抗衰老的功效。[0030]3本发明研究了银杏叶提取物的活性成分为银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、白果内酯五种特征性内酯类成分和芦丁、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、杨梅素十种单体成分，对纤维细胞MMP-I蛋白和CollagenI蛋白的表达的影响，清楚而透彻的研究了银杏叶提取物抗衰老的活性成分组成和机理，弥补了对银杏叶延缓衰老活性成分构效关系研究的空白。附图说明[0031]图1是10种单体成分对成纤维细胞MMP-I抑制活性的测定[0032]图2是10种单体成分对成纤维细胞CollagenI表达的影响[0033]其中，1一芦丁2—槲皮素-3-0-葡萄糖苷3—山奈酚-3-0-葡萄糖苷[0034]4—异鼠李素-3-0-葡萄糖苷5—杨梅素6—银杏内酯A[0035]7—银杏内酯B8—银杏内酯C9一银杏内酯J[0036]10—白果内酯具体实施方式[0037]实施例1银杏叶组合物及其提取方法[0038]1银杏叶干燥后粉碎，过100目筛，加入15倍的95%乙醇超声提取lh，提取3次，合并上清液并于50°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0039]2银杏叶粗提物加10倍水稀释、离心，上清液经DM130大孔吸附树脂进行吸附，60%乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0040]3银杏叶洗脱液依次用732阳离子吸附树脂和HPD5000大孔吸附树脂进行吸附，60%乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0041]活性成分及含量检测：[0042]称取适量以上浸膏进行复溶，用甲醇将其配成lmgmL的浓度，通过UPLCMSMS和HPLCDAD法对活性提取其内酯类成分、银杏酸成分和黄酮类成分进行定量分析，具体如下：[0043]1内酯成分的含量检测：[0044]ESI-模式：干燥氮气流速lOLmin，温度35°C，雾化器压力：30psi;毛细管电压：3500V;MRM模式定量，各对照品毛细管出口电压和碰撞能量经过优化，以获得更稳定的离子和更尚的相应。[0045]色谱条件:ACQUITYUPLCBEHCl81.7μπι色谱柱，流动相为乙腈和0.1%甲酸溶液，梯度洗脱0-0.5分钟，10%A，0.5-4分钟，90%Α，流速0.3mlmin，柱温30°C，进样量2μ1〇[0046]标准曲线的绘制:分别精密量取银杏内酯A、B、C、J和白果内酯标准对照品适量，置于容量瓶中，加入甲醇制备含单一对照品质量浓度分别为0.008、0.008、0.008、0.0015、0.050mgml的混合对照品溶液，通过改变进样体积来改变混合对照品溶液的浓度，将配置好的混合对照品按上述色谱条件进行分析，绘制标准曲线。[0047]样品测定:称取适量以上浸膏进行复溶，用甲醇将其配成lmgmL的浓度，按上述色谱条件进行分析.[0048]2黄酮类成分含量检测：[0049]色谱条件:流动相为乙腈和0.2%磷酸溶液，流速为0.5mlmin，柱温为30°C，进样量为5μ1，检测波长为270nm，梯度洗脱如下表：[0052]标准曲线的绘制:分别精密称取芦丁、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、杨梅素对照品适量，加甲醇制备含单一对照品质量浓度分别为0.012、0.006、0.012、0.012、0.012的混合对照品溶液，并用甲醇稀释至不同浓度的混合对照品溶液，按照上述色谱条件进行检测，绘制标准曲线。[0053]样品测定:称取适量以上浸膏进行复溶，用甲醇将其配成lmgmL的浓度，经0.22μπι微孔滤膜过滤后按照上述液相条件进行检测。[0054]⑶银杏酸成分含量检测[0055]质谱条件:ESI-模式:毛细管电压:2500V，去溶剂气流速800LH，去溶剂气温度450°C，源温150°C，雾化器压力：30psi;MRM模式，各对照品毛细管出口电压和碰撞能量经过优化，以获得更稳定的离子和更高的相应。[0056]色谱条件:ACQUITYUPLCBEHCl81.7μπι色谱柱，流动相为乙腈和0.1%甲酸溶液，梯度洗脱0-1·〇分钟，10%Α，1·0-6·0分钟，90%Α，流速为0·4mlmin，柱温35°C，样品室温l〇°C，进样量为10μ1。[0057]标准曲线的绘制:分别精密称取银杏算Cl3:0、Cl5:0、Cl5:1、Cl7:1、Cl7:2对照品适量，用甲醇配置为2mgml的混合溶液，并用甲醇逐级稀释，进入液相色谱进行检测，绘制标准曲线。[0058]样品测定:称取适量以上浸膏进行复溶，用甲醇将其配成lmgmL的浓度，经0.22μπι微孔滤膜过滤，进入液相色谱仪进行测定结果如下。[0060]实施例2银杏叶组合物及其提取方法[0061]1银杏叶干燥后粉碎，过80目筛，加入12倍的90%乙醇超声提取1.5h，提取2次，合并上清液并于40°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0062]2银杏叶粗提物加8倍水稀释、离心，上清液经DM130大孔吸附树脂进行吸附，55%乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0063]3银杏叶洗脱液依次用732阳离子吸附树脂和HPD5000大孔吸附树脂进行吸附，55%乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0064]活性成分及含量检测：同实施例1，结果如下。[0066]实施例3银杏叶组合物及其提取方法[0067]1银杏叶干燥后粉碎，过120目筛，加入18倍的100%乙醇超声提取0.5h，提取4次，合并上清液并于55°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0068]2银杏叶粗提物加8倍水稀释、离心，上清液经DM130大孔吸附树脂进行吸附，65%乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0069]3银杏叶洗脱液依次用732阳离子吸附树脂和HPD5000大孔吸附树脂进行吸附，65%乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0070]活性成分及含量检测：同实施例1，结果如下表。[0072]实施例4-6银杏叶组合物[0073]将银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、白果内酯、芦丁、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、杨梅素10种单体按照下述重量份进行混合，如下表：[0074][0075]对比例1不同吸附树脂处理工艺得到的银杏叶组合物[0076]除步骤⑵采用AB-8大孔树脂外，其余同实施例1，具体如下：[0077]1银杏叶干燥后粉碎，过100目筛，加入15倍的95%乙醇超声提取Ih，提取3次，合并上清液并于50°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0078]2银杏叶粗提物加10倍水稀释、离心，上清液经AB-8大孔吸附树脂进行吸附，60%乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0079]3银杏叶洗脱液依次用732阳离子吸附树脂和HPD5000大孔吸附树脂进行吸附，60%乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0080]活性成分及含量检测：同实施例1，结果如下。[0083]对比例2不同吸附树脂处理工艺得到的银杏叶组合物[0084]除步骤⑶采用DlOl大孔树脂外，其余同实施例1，具体如下：[0085]1银杏叶干燥后粉碎，过100目筛，加入15倍的95%乙醇超声提取lh，提取3次，合并上清液并于50°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0086]2银杏叶粗提物加10倍水稀释、离心，上清液经DM130大孔吸附树脂进行吸附，60%乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0087]3银杏叶洗脱液依次用732阳离子吸附树脂和DlOl大孔吸附树脂进行吸附，60%乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0088]活性成分及含量检测：同实施例1，结果如下。[0090]对比例3不同提取工艺得到的银杏叶组合物[0091]将实施例1步骤1制备得到的银杏叶粗提物经过有机溶剂萃取分离得到银杏叶不同萃取部位组合物，其余同实施例1，具体如下：[0092]1银杏叶干燥后粉碎，过100目筛，加入15倍的95%乙醇超声提取lh，提取3次，合并上清液并于50°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0093]2取上述所得银杏叶粗提物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，将萃取所得三个部位的提取物先用旋转蒸发仪进行浓缩，再通过真空干燥箱将浓缩液进行干燥，最终得到三个萃取部位的银杏叶浸膏即石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部提取物。[0094]活性成分及含量检测：同实施例1，结果如下。[0095]石油醚部位：[0097]乙酸乙酯部位[0099]正丁醇部位[0101]对比例4不同洗脱工艺得到的银杏叶组合物[0102]除步骤⑵和⑶洗脱液采用95%乙醇外，其余同实施例1，具体如下：[0103]1银杏叶干燥后粉碎，过100目筛，加入15倍的95%乙醇超声提取lh，提取3次，合并上清液并于50°C下减压浓缩，得到银杏叶粗提物；[0104]2银杏叶粗提物加10倍水稀释、离心，上清液经DM130大孔吸附树脂进行吸附，95%乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；[0105]3银杏叶洗脱液依次用732阳离子吸附树脂和HPD5000大孔吸附树脂进行吸附，95%乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。[0106]对比例5-7银杏叶组合物[0107]将各单体按照下述重量份进行混合，如下表：[0109]其中，与实施例1相比，对比例5不含有银杏内酯B，但是含有9.7重量份的银杏内酯M;对比例6不含有芦丁，但是含有16.1重量份的白果醇;对比例7不含有银杏内酯J和槲皮素-3-0-葡萄糖苷，但是含有2.5重量份的银杏内酯M和4.3重量份的芹菜素-7-葡糖苷。。[0110]试验例1银杏叶组合物及活性成分延缓衰老活性检测[0111]1.1成纤维细胞活力检测：[0112]将银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、白果内酯、芦丁、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、山奈酸-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、杨梅素十种单体成分分别用1%的DMSO溶液配置成浓度为0.4,0.2,0.1，0.05mgmL的溶液，并设有阴性对照组。[0113]成纤维细胞以IXIO5AiL的密度铺于96孔板，每孔加入0.ImL细胞悬浮液，待细胞贴壁后用于加药。药物作用24h后，加入用无血清培养基以1:10稀释好的CCK-8试剂IlOyL反应lh，于酶标仪450nm测定其吸光度。按下述公式计算细胞存活率。[0114]细胞存活率=各组吸光度空白组吸光度）X100%[0115]结果如下：[0116]表1单体成分对成纤维细胞的细胞活力的影响[0117][0118]由上表可知，异鼠李素-3-0-葡萄糖苷和杨梅素在0.4mgmL浓度下，细胞存活率分别（63.86±0.7%和58.58±4.62%，存在一定的细胞毒性，在0.2mgmL浓度下，细胞存活率均达到了80%以上；[0119]另外，芦丁、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷以及银杏内酯A、B、C、J和白果内酯在〇.4mgmL浓度下，细胞活率均已达到80%以上，故结合实际情况，均选择0.2mgmL和0.lmgmL为接下来MMP-I指标检测的实验浓度。[0120]1.2MMP-1蛋白表达检测：[0121]成纤维细胞以2XIO4AiL的密度铺于6孔板，每孔加入ImL细胞悬浮液，待细胞贴壁后用于加药。待药物作用24h后，取每组细胞上清液，1000转离心15min，离心后取其上清用于测试。按照MMP-I检测试剂盒操作流程进行测试。先拟合标准曲线，在此基础上计算样本MMP-I的含量，结果如附图1所示。[0122]结果表明，山奈酚-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、杨梅素和银杏内酯A和白果内酯均可以抑制MMP-I的表达，且相对于空白对照组，白果内酯对MMP-I的影响具有显著性差异P〇.05，山奈酸-3-0-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、杨梅素和银杏内酯A对MMP-I的影响均具有非常显著性的差异P0.01。[0123]1.3对CollagenI蛋白表达的影响[0124]成纤维细胞以2XIO4AiL的密度铺于6孔板，每孔加入ImL细胞悬浮液，待细胞贴壁后用于加药。待药物作用24h后，取每组细胞上清液，1000转离心15min，离心后取其上清用于测试。按照CollagenI检测试剂盒操作流程进行测试。先拟合标准曲线，在此基础上计算样本CollagenI的含量，结果见附图2〇[0125]结果表明，相对于对照组，白果内酯对成纤维细胞CollagenI的表达具有显著的促进作用P〇.05，银杏内酯A对成纤维细胞CollagenI的表达具有非常显著的促进作用Ρ0·01〇[0126]1.4银杏叶组合物抗氧化活性研究[0127]银杏叶提取物对成纤维细胞细胞活力、对成纤维细胞MMP-I抑制活性、对CollagenI蛋白表达的影响的测定方法同1.1-1.3。[0128]其中，将不同实施例及对比例制备得到的银杏叶提取物用无水乙醇溶解并配置成1、0.5、0.25、0.125mgmL;并设有溶剂对照组和阴性对照组，进行成纤维细胞细胞活力测定，再根据纤维细胞细胞活力测定结果确定后续实验所需浓度。[0129]表2不同银杏叶组合物对成纤维细胞细胞活力的影响[0130][0131][0132]0.5mgml以下浓度，各银杏叶组合物均能满足纤维细胞细胞活力达到80%以上，为降低成本，并提高检测灵敏度，选择〇.02和0.01mgml浓度进行后续实验。[0133]表3银杏叶组合物对成纤维细胞分泌MMP-I的影响[0134][0135]注：与阴性对照组相比，*P0.05，#P0.01。[0136]由表3数据可知，本发明提供的银杏叶组合物在抑制MMP-I蛋白表达方面的效果显著高于对比例1-7,说明本发明提供的银杏叶组合物具有更强的生物活性，无论是组合物配比还是组成方面的改变均会显著影响其抗衰老的效果。[0137]表4银杏叶组合物对成纤维细胞CollagenI蛋白表达的影响[0140]注：与阴性对照组相比，*P0·05，#P0·01。[0141]由表4数据可知，本发明提供的银杏叶组合物在促进CollagenI蛋白表达方面的效果显著高于对比例1-7,进一步说明本发明提供的银杏叶组合物具有更强的生物活性，无论是组合物配比还是组成方面的改变均会显著影响其抗衰老的效果。[0142]上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

权利要求：1.一种具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶组合物中按照重量份数计含有50-95份银杏叶总内酯、22-60份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸小于0.0035份;优选地，所述银杏叶组合物含有70-90份银杏叶总内酯、28-45份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸含量小于0.0030份;更优选地，所述银杏叶组合物含有72-78份银杏叶总内酯、34-44份银杏叶总黄酮，且银杏叶银杏酸含量小于0.0028份。2.根据权利要求1所述的具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶总内酯选自银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶总内酯按照重量份数计，选自9-15份银杏内酯A、5-10份银杏内酯B、7-12份银杏内酯C、1-8份银杏内酯J和48-55份白果内酯中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶总黄酮选自芦丁、撇皮素_3-〇_匍萄糖苷、山奈酸-3-0-匍萄糖苷、异鼠李素-3-0-匍萄糖苷和杨梅素中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶总黄酮按照重量份数计，选自12-18份芦丁、3-8份槲皮素-3-0-葡萄糖苷、1-5份山奈酚ΙΟ-葡萄糖苷、1-5份异鼠李素-3-0-葡萄糖苷和15-24份杨梅素中的一种或多种。6.根据权利要求3或5所述的具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶组合物按照重量份数计，包括2-4份山奈酚-3-0-葡萄糖苷、2-4份异鼠李素-3-0-葡萄糖苷、18-20份杨梅素、10-12份银杏内酯A和48-52份白果内酯。7.根据权利要求6所述的具有延缓衰老作用的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏叶组合物按照重量份数计，还包括15-18份芦丁、4-6份槲皮素-3-0-葡萄糖苷、6-9份银杏内酯B、8-11份银杏内酯C和2-7份银杏内酯J。8.如权利要求1-7任一项所述银杏叶组合物的制备方法，包括以下步骤:将各组分单体按照比例混合即得。9.如权利要求1-7任一项所述银杏叶组合物的制备方法，包括以下步骤：1银杏叶干燥后粉碎，加入乙醇超声提取，上清液减压浓缩，得到银杏叶粗提物；2银杏叶粗提物加水稀释、离心，上清液经大孔吸附树脂进行吸附，乙醇为洗脱液，得到的银杏叶洗脱液；3银杏叶洗脱液依次用阳离子吸附树脂和大孔吸附树脂进行吸附，乙醇为洗脱液，减压浓缩即得。10.权利要求1-7任一项所述银杏叶组合物在制备延缓衰老化妆品功效添加剂中的应用。

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