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申请/专利权人：首都师范大学

摘要：本发明涉及一种检测甲基化半胱氨酸总量的方法和试剂盒，属于生物技术和分析测试领域。利用对游离Hcy具有高响应、对氧化态Hcy具有中等相应的核酸适配体构建倏逝波光纤传感器。荧光标记的互补链和tHcy与光纤上固定的核酸适配体竞争结合。荧光信号的下降值与血清中tHcy浓度正相关。根据荧光降低百分数来计算血清中的tHcy浓度。本发明检测tHcy仅需要1微升血清，将血清稀释1000倍后进行检测，检测结果与商业每循环法一致。与酶循环法相比，本发明方法具有价格低，光纤可重复使用30次以上、检测速度快，最快5分钟、不需要酶、设备小型化、操作简单等优点，具有极好临床应用价值。

主权项：1.一种检测甲基化半胱氨酸总量的方法，，其特征在于，利用对游离Hcy具有高响应、对氧化态Hcy具有中等响应的核酸适配体构建倏逝波光纤传感器，该传感器基于竞争检测模式，荧光标记的互补链、还原态Hcy、氧化态Hcy与光纤上固定的核酸适配体竞争结合，还原态游离态Hcy和氧化态Hcy的浓度越高，越多的光纤上固定的核酸适配体与其结合，与荧光标记的互补链结合的核酸适配体越少，荧光响应值越低，荧光信号的下降值与血清中tHcy浓度正相关，根据荧光降低百分数来计算血清中的tHcy浓度，另外，光纤界面上的吐温80纳米层对Hcy进行原位富集，极大地提高了光纤界面附近的还原态Hcy和氧化态Hcy的浓度，更加促进了其与光纤上固定的核酸适配体的结合，荧光响应值更低，因而检测灵敏度更高，将含不同tHcy浓度的血清在缓冲液中稀释1千倍，或者将血清与还原剂三2-羧乙基膦Tris2-carboxyethylphosphine，简称TCEP的混合液在缓冲液中稀释1千倍，再加入终浓度为20nM的带Cy5.5修饰的互补链，经过以下三个步骤将混合物引入光纤传感器：1泵入缓冲液30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；2耗时20秒将靶标和互补链的混合物泵入光纤反应池并保持180秒，实时测定荧光信号；3通入0.5％SDS,pH1.9洗涤缓冲液冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的互补链，重复1-3，进行下一个样品的检测，以tHcy浓度为横坐标，以相对荧光信号下降百分比为纵坐标绘制工作曲线，如前述的方法进行真实样本中tHcy的检测，根据荧光信号的响应值，利用工作曲线计算tHcy的浓度。

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