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申请/专利权人：广东省农业科学院动物科学研究所

摘要：本发明公开了一种利用鸡全基因组CRISPR高通量技术筛选呕吐毒素抗性基因的方法。属于动物育种技术领域。本发明先获得了稳定表达Cas9蛋白的DF‑1细胞系。随后构建鸡全基因组sgRNA文库质粒并将其包装成慢病毒感染DF‑1‑Cas9细胞系，利用流式细胞术获得敲除细胞库。以呕吐毒素为模型攻毒敲除细胞库，收集存活细胞并扩大培养，提取细胞基因组信息进行高通量测序，再使用MAGeCK软件进行差异分析，最后构建单基因敲除细胞系验证抗性基因。本发明构建了鸡全基因组敲除文库筛选技术，成功筛选到呕吐毒素抗性基因，对禽细胞建立全基因组CRISPR敲除细胞库的流程提供参考意义，为鸡功能基因的高通量筛选奠定基础。

主权项：1.一种利用鸡全基因组CRISPR高通量技术筛选呕吐毒素抗性基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建鸡全基因组sgRNA文库；功能基因筛选及开放阅读框分析、功能基因sgRNA识别位点引导序列预测、sgRNA表达载体活性鉴定、全基因组脱靶位点活性检测、利用sgRNACas9在线软件搜寻特异性较高的sgRNA作为候选sgRNA，构建鸡全基因组敲除文库；针对鸡17421个蛋白质编码基因，选取靶基因起始密码子ATG下游200bp基因组序列，利用sgRNACas9在线软件搜寻特异性较高的sgRNA作为候选sgRNA，设计鸡全基因组sgRNA，每个基因3~5条sgRNA，共81763条，同时以基因组无靶点的1000条sgRNA作为阴性对照组；（2）将鸡全基因组sgRNA文库进行慢病毒包装，感染稳定表达Cas9蛋白的宿主细胞，并筛选以获得稳定表达鸡全基因组sgRNA文库的敲除细胞库；具体的：（21）将带有Cas9蛋白的质粒包装成慢病毒，获得慢病毒上清；（22）使用慢病毒上清感染宿主细胞，并使用杀稻瘟菌素筛选稳定转染Cas9蛋白的宿主细胞，最终通过有限稀释法获得稳定表达Cas9蛋白的细胞系；所述杀稻瘟菌素的浓度为2~4µgml；慢病毒上清与宿主细胞培养基的体积比为1:1；所述宿主细胞为DF-1细胞系；（23）应用电转方法扩增sgRNA慢病毒质粒文库；（24）利用鸡全基因组sgRNA慢病毒文库感染稳定表达Cas9蛋白的细胞系，通过流式细胞术筛选稳定表达鸡全基因组sgRNA文库的敲除细胞库；所述鸡全基因组sgRNA慢病毒文库的MOI为0.3；（3）依次用浓度4µgml的呕吐毒素和浓度2µgml的呕吐毒素处理细胞，待敲除细胞库只有极少量的细胞存活，换为完全培养基培养；（4）提取细胞基因组信息进行高通量测序，使用MAGeCK软件进行差异分析，得到候选基因；（5）构建单基因敲除细胞系验证；所述呕吐毒素抗性基因为LINGO3基因。

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