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一种基于CRISPR技术的eccDNA快速检测方法 

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申请/专利权人:上海交通大学

摘要:本发明属于生物技术领域,涉及一种基于CRISPR技术的eccDNA快速检测方法,所述方法使用CRISPR‑Cas9系统靶向包含目标序列的eccDNA,在靶位点的切口处进行单链DNA探针辅助的酶修饰之后,直接在恒温下对目标eccDNA开启滚环扩增,再使用CRISPR‑Cas14系统靶向结合单链状态的滚环扩增产物,激发Cas14的反式切割活性,实现对信号的二次放大;本发明由于在检测过程中存在多步特异性识别与信号放大过程,在对eccDNA进行检测前,不需要对基因组内存在的线性DNA进行消化,显著缩短了染色体外环状DNA的检测时间,降低了检测成本,能实现1fM水平的检测限,能成功在肿瘤细胞中检测到携带肿瘤疾病相关基因片段的eccDNA。

主权项:1.一种基于CRISPR技术的eccDNA快速检测方法,其特征在于,在不消化基因组中线性DNA的情况下,包括如下所述的步骤:S1、利用CRISPR技术,将Cas9n-sgRNA结合到目标双链环形DNA的靶位点;S2、根据所述靶位点序列信息合成长度为40nt的单链DNA探针,并将所述40nt的单链DNA探针结合到sgRNA的非互补链上;S3、以长度为40nt的单链DNA探针为模板,在靶位点处使用Klenow大片段酶延长sgRNA的非互补链;S4、以sgRNA的非互补链延长区域为起点,以与40nt的单链DNA探针对应的20nt探针为引物,对目标双链环形DNA进行链取代反应,使目标双链环形DNA变为单链环状DNA;S5、在反应体系中加入滚环扩增引物,使用Phi29对链取代得到的单链环状DNA进行滚环扩增,获得滚环扩增产物;S6、利用CRISPR技术,将Cas14a-sgRNA和报告探针结合到滚环扩增产物的靶位点,激发反式切割活性,切割报告探针;S7、定容反应体系,在荧光分光光度计下进行荧光检测。

全文数据:

权利要求:

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