买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：上海元戊医学技术有限公司

摘要：本发明公开了一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含：步骤S1，将含有多能干细胞的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液铺在软质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经祖细胞；步骤S2，将含有中脑多巴胺能神经祖细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液铺在硬质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经前体细胞。本发明通过在不同的诱导分化阶段使用不同硬度培养基底调控细胞机械传导信号，在短时间内产生大批高纯度中脑多巴胺能神经前体细胞，显著缩短分化时间并提高细胞制品纯度和产量。中脑多巴胺能神经前体细胞能够进一步发展为成熟的中脑多巴胺能神经元，可应用于帕金森病的细胞药物。

主权项：1.一种体外高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤S1，将含有多能干细胞的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液铺在软质细胞培养基底上，定向分化培养得到中脑多巴胺能神经祖细胞；所述软质细胞培养基底为等效杨氏模量为5kPa的聚丙烯酰胺凝胶；所述中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养液包括以下成分组成：神经细胞基础培养基、1×N2补充剂、1×不含维生素A的B27补充剂、2mML-谷氨酰胺、10μMTGF-β信号通路抑制剂SB431542、250nMBMP信号通路抑制剂LDN193189、1μM音猬因子通路激活剂SAG、10μMROCK抑制剂Y27632，以及GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021，所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021分化第1天至第4天的浓度为0.7μM，分化第5天至第10天的浓度为7.5M；步骤S2，将含有该中脑多巴胺能神经祖细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液铺在硬质细胞培养基底上，定向分化培养得到该中脑多巴胺能神经前体细胞；所述硬质细胞培养基底为杨氏模量为65GPa的硼硅酸盐玻璃；所述中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养液包括以下成分组成：神经细胞基础培养基、不含维生素A的B27补充剂、2mML-谷氨酰胺、20ngml脑源性神经营养因子BDNF、20ngml神经胶质细胞系衍生的神经营养因子GDNF、0.2mML-抗坏血酸、1ngmlTGF-β3、0.5mM激活剂cAMP、10μMDAPT，以及3μMGSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021；于上述步骤中，包括：1人多能干细胞的培养，包括：使用Essential8培养基培养人多能干细胞于玻连蛋白或层粘连蛋白包被的孔板上，置于37℃，CO2浓度5％，饱和湿度的培养箱内；每4-5天，当多能干细胞生长至70-80％聚合度时，使用EDTA或者中性蛋白酶消化传代一次，传代比例为1：4到1：6之间；所用的多能干细胞应经过严格的多能性验证，并定期进行支原体检测；每天更换新鲜的Essential8培养基，并检查细胞的形态和生长状态；2制备软质细胞培养基底：杨氏模量为5kPa的聚丙烯酰胺凝胶，包括：①将盖玻片在本生灯火焰中过火，然后浸泡在0.1NNaOH中，风干；②将少量3-氨基丙基三甲氧基硅烷均匀地铺在玻璃表面上；4～5分钟后，用蒸馏水清洗并浸泡盖玻片；然后将盖玻片浸入0.5％戊二醛的PBS溶液中30分钟；然后用蒸馏水彻底清洗盖玻片并风干；③将25微升丙烯酰胺双丙烯酰胺混合物放在盖玻片上，并用一小块圆形盖玻片覆盖；其中，所述丙烯酰胺双丙烯酰胺混合物包含10％丙烯酰胺和浓度为0.025％的交联剂双丙烯酰胺；④聚合后，取下圆形盖玻片，用200mMHEPES冲洗凝胶，所述HEPES的pH为8.5；然后将凝胶吸干，并将200μLSulfo-SANPAH移液至凝胶表面，所述Sulfo-SANPAH包含50mM磺基琥珀酰亚胺基64‘-叠氮基-2’-硝基苯基和200mM的pH8.5的HEPES缓冲液；然后，将盖玻片室暴露在无菌罩紫外线下5分钟，盖玻片距离紫外线光影6英寸；然后除去Sulfo-SANPAH溶液，并重复光活化过程；⑤光活化后，将聚丙烯酰胺片在200mMHEPES中洗涤数次，所述HEPES的pH为8.5；然后，将玻连蛋白或层粘连蛋白溶液加到聚丙烯酰胺凝胶上，并在4℃下孵育过夜；用200mMHEPES洗涤后，将所述聚丙烯酰胺凝胶保存在4℃；为了形成细胞培养室，用真空油脂将盖玻片固定在70×50×6毫米有机玻璃板上，该板的中心有一个直径为35毫米的环形孔；在铺板细胞之前，将所述聚丙烯酰胺凝胶浸泡在37℃培养基中30～45分钟；3诱导人多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经祖细胞，包括：⑥第0天，当人多能干细胞成长至汇合度70-80％的时候，确认细胞状态良好后，使用Accutase消化细胞；计数后，接种细胞于玻连蛋白或层粘连蛋白包被的杨氏模量为5kPa的聚丙烯酰胺凝胶上，细胞密度为40万个细胞cm2；加入新鲜的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养基；⑦第1天至第3天，每天更换新鲜的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养基；⑧第4天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养基，但是不包括ROCK抑制剂Y27632，同时提高培养基中3μMGSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021的浓度；⑨第6天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第4天使用的培养基相同；⑩第7天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养基，但是不包括所述TGF-β信号通路抑制剂SB431542，所述BMP信号通路抑制剂LDN193189和所述音猬因子通路激活剂SAG； 第9天，将之前的培养基吸出，加入新鲜的中脑多巴胺能神经祖细胞诱导培养基，培养基成分跟第7天使用的培养基相同；4诱导中脑多巴胺能神经祖细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞，包括：①第10天，将前一天加入的培养基吸出，加入新鲜的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养基；②第11天，使用Accutase消化细胞30-40分钟，接种于15μgml聚-L-鸟氨酸溶液+1μgml层粘连蛋白+2μgml纤连蛋白包被的杨氏模量为65GPa的硼硅酸盐玻璃上，接种密度为80万个细胞cm2，使用与第10天相同的培养基培养；③第12天，更换新鲜的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养基，但是不含有所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021；另外，在培养基中添加10μMDAPT；④第13天至第14天，每天更换新鲜的中脑多巴胺能神经前体细胞诱导培养基；⑤收集并低温保存中脑多巴胺能神经前体细胞：在第15天，使用Accutase消化细胞20-40分钟，然后通过孔径为40μm的细胞过滤器以获得单细胞；进行细胞计数，离心，以8百万个细胞毫升的密度重悬于细胞冻存液，然后将细胞分装放入冻存管中；最后，将收集到的细胞保存于低温储存设施中。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 上海元戊医学技术有限公司 一种高效诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法