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申请/专利权人：清华大学
摘要：本发明提出了基因编辑细胞脱靶检测的方法，所述方法包括：1对细胞进行基因编辑，获得的基因编辑细胞中含有蛋白‑单链DNA复合物；2从所述基因编辑细胞中分离出单链DNA；3将所述单链DNA构建测序文库，对所述测序文库进行测序，获得测序结果；4将所述测序结果与参考序列进行比对分析，确定脱靶信息。利用本发明的方法可以确定脱靶信息，具有高准确性、高灵敏度和高普适性等特点，适于广泛应用。
主权项：1.一种基因编辑细胞脱靶检测的方法，其特征在于，包括：（1）对细胞进行基因编辑，获得的基因编辑细胞中含有蛋白-单链DNA复合物；（2）从所述基因编辑细胞中分离出单链DNA；（3）将所述单链DNA构建测序文库，对所述测序文库进行测序，获得测序结果；（4）将所述测序结果与参考序列进行比对分析，确定脱靶信息；所述蛋白选自复制蛋白A；所述基因编辑采用的基因编辑工具包括：TALEN、ZFN或者CRISPR系统介导的CRISPRCas9基因编辑器、单碱基编辑器或者先导编辑器；步骤（2）包括：将含有所述基因编辑细胞的细胞液与刀豆蛋白A磁珠共孵育，去除上清，用含有所述蛋白的抗体的缓冲液重悬磁珠，孵育，洗涤磁珠；用含有pA-MNase的洗涤缓冲液重悬磁珠，孵育，洗涤磁珠；用含有EDTA的缓冲液重悬磁珠，孵育，向试管中加入CaCl2溶液重悬磁珠，冰上消化，终止反应，离心，置于磁力架上，收集上清液；所述重悬磁珠时，通过敲击试管以混匀；将所述上清液、蛋白酶K和载体RNA进行反应，得到反应液；从所述反应液中分离出单链DNA；步骤（1）包括：将预先构建的用于基因编辑的载体转染至细胞中，培养细胞至预定时间后进行步骤（2）；其中，当采用CRISPRCas9基因编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为48~96小时；当采用单碱基编辑器或者先导编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为12~48小时。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 清华大学 基因编辑细胞脱靶检测的方法
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