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申请/专利权人：中国兽医药品监察所

摘要：本发明涉及鸭瘟病毒UL56基因3’端缺失和LORF5基因缺失突变株及其构建方法与应用，本发明提供一种UL56基因3’端缺失和LORF5基因缺失的重组鸭瘟病毒毒株，该毒株具有减弱的毒力，对鸭无致病性，且具有良好的免疫原性，能够实现抗鸭瘟病毒的免疫保护。本发明提供的减毒鸭瘟病毒毒株能够用于制备鸭瘟活疫苗，或作为活病毒载体经插入其它病原的抗原基因制备基因工程活载体疫苗，具有很大的应用潜力和市场。

主权项：1.一种减毒的鸭瘟病毒毒株，其特征在于，所述鸭瘟病毒毒株的UL56基因失活或UL56基因和LORF5基因同时失活；优选的，所述失活为缺失UL56基因3’端60bp和LORF5基因5’端2638bp。

全文数据：鸭瘟病毒UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失突变株及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及鸭瘟病毒UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失突变株及其构建方法与应用。背景技术[0002]鸭瘟病毒，又名鸭肠炎病毒Duckenteritisvirus，DEV，可感染鸭、鹅及其它雁形目禽类，引起血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变的急性、接触性、败血性传染病一鸭病毒性肠炎Duckviralenteritis，DVE，或称鸭痕（Duckplague，DPSandhuand]\^七《^117,2008。自1923年被首次发现以来（1^11161:，1923，鸭瘟相继发生于法国、印度、比利时、英国、泰国和加拿大等国家（殷震和刘景华，1997，流行范围和感染禽类的种类有逐步扩大的趋势。目前发现至少48种雁形目中的禽类对DEV易感Kaletaetal.，2007。鸭瘟是一种广泛的嗜全身性感染的传染病，发病率和死亡率都很高，给水禽养殖业带来巨大损失。免疫接种是预防和控制该病暴发的重要措施，目前我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。DEV具有良好的免疫原性，免疫力产生快速，免疫后3天便可抵抗鸭瘟强毒的攻击，且免疫期可达一年之久。[0003]DEV属于痕疼病毒科、甲型痕疼病毒亚科、马立克病毒属、鸭痕疼病毒1型http:www.ictvonline.org。李玉峰等应用Shot-gun方法首次完成了DEV—我国鸭痕商品化疫苗DEVVAC的全基因组测序。DEVVAC基因组全长为158,089bp，G+C含量为44.91%，由长独特区（UniqueLong,UL和短独特区（UniqueShort,US组成，US区两端为一对反向重复序列，分别称为内部重复序列（InternalRepeat，IR和末端重复序列（TerminalRepeat，TR。基因组结构为UL-IR-US-TR，呈典型的D型疱瘆病毒基因组结构Lietal.，2009。发明人在早期的研究中完成了我国鸭瘟病毒强毒参考株的全基因组序列测定，该毒株基因组全长为162，131bp，共78个0RF，编码76个蛋白（Yangetal.，2014。[0004]随着基因工程技术的发展，重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗研究的热点。DEV作为活疫苗载体具有以下优点：（1基因组容量大，可插入和表达多种外源基因；（2能够迅速产生免疫力，免疫后3天即可产生一定的保护；（3免疫期长，可达1年；（4宿主范围广，至少可感染48种雁形目中的禽类Kaletaetal.,2007。因此，开展鸭瘟重组病毒以及鸭瘟重组病毒活载体疫苗的研究具有重要意义。发明内容[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供鸭瘟病毒UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失突变株及其构建方法与应用。[0006]首先，本发明提供一种减毒的鸭瘟病毒毒株，所述鸭瘟病毒毒株的UL56基因失活或UL56基因和L0RF5基因同时失活。[0007]其中，减毒的鸭瘟病毒毒株是指鸭瘟病毒毒株对宿主的毒力较亲本毒株的毒力降低，或鸭瘟病毒毒株对宿主不具有致病性。[0008]所述失活可以通过任何可以使UL56基因编码蛋白失去活性的遗传改造实现，包括但不限于全部或部分缺失UL56基因或UL56基因的一个或多个核苷酸的插入或替换。[0009]优选地，所述失活为缺失UL56基因3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp。[0010]更进一步地，本发明提供的减毒的UL56基因3’端缺失的同时L0RF5基因失活，并插入外源基因。[0011]优选地，所述外源基因为筛选标记基因或非鸭瘟病毒抗原的基因，优选地，所述筛选标记基因为焚光蛋白基因。[0012]所述非鸭瘟病毒抗原的基因是指除了鸭瘟病毒来源的抗原以外的抗原编码基因，优选为禽流感病毒HA基因、病毒性肝炎VPl基因、细小病毒VP3基因或鸭坦布苏病毒E蛋白基因。[0013]所述荧光蛋白包括但不限于RFP，GFP，或YFP等本领域公知公用的荧光蛋白。[0014]另一方面，本发明还提供所述减毒的鸭瘟病毒毒株的构建方法，包括如下步骤：[0015]1构建UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活，或UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活并插入外源基因的转移载体；[0016]2将步骤1获得的转移载体和鸭瘟病毒亲本毒株共转染至宿主细胞中，经同源重组，筛选得到UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活，或UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活并在该位置插入外源基因的鸭瘟病毒毒株。[0017]优选地，所述转移载体为以PUC-18克隆载体为骨架载体，按顺序连接UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失的左同源臂和右同源臂;或按顺序连接UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失的左同源臂序列、外源基因表达盒和右同源臂序列；[0018]具体地，所述减毒的鸭瘟病毒毒株的构建方法，包括如下步骤：[0019]1以鸭瘟病毒CVCCAV1221基因组为模板，采用引物SEQIDNO.10和SEQIDNO.11扩增同源重组的左同源臂，采用引物SEQIDNO.12和SEQIDNO.13扩增右同源臂，将左同源臂和右同源臂依次连接至PUC-18载体，或将左同源臂、外源基因表达盒和右同源臂依次连接至PUC-18载体，构建转移载体。优选的，外源基因为红色荧光蛋白编码基因时其表达盒的序列如SEQIDNO.5所示。[0020]2将步骤1构建的转移载体与亲本毒株共转染至宿主细胞，初步获得的重组病毒，将重组病毒进行蚀斑纯化，获得缺失UL56基因3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp的重组鸭瘟病毒。[0021]其中，所述亲本毒株为鸭瘟病毒CVCCAV1221强毒株或将鸭瘟病毒CVCCAV1221强毒株经鸡胚成纤维细胞和鸡胚连续传代获得的克隆纯化的弱毒株;所述宿主细胞为鸡胚成纤维细胞CEF或鸭胚成纤维细胞DEF;[0022]UL56基因和L0RF5基因是否具有与病毒毒力相关的功能目前未知，发明人在进行鸭瘟病毒毒力的研究中，偶然发现缺失UL56基因3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp的鸭瘟病毒毒株的毒力明显降低，甚至对鸭不具有致病性。然而很多可以减弱病毒毒力的基因的缺失经常导致病毒抗原性的丧失，出乎意料的是，缺失UL56基因3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp不会对鸭瘟病毒的抗原性造成影响，即鸭瘟病毒UL56基因3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp缺失的突变株具有显著降低的毒力并且具有很好的免疫原性，是制备疫苗所需要的毒株的理想选择。[0023]本发明首次证实了UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失能够减弱鸭瘟病毒的毒力，UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失毒株对鸭安全，但仍保留了良好的免疫原性，因此，该重组病毒可以用于制备鸭瘟活疫苗，预防鸭瘟。此外，在重组活载体疫苗的制备中，很多外源抗原导入活病毒载体后出现不兼容的现象，即外源抗原基因无法大量表达，导致外源抗原的免疫原性很低，无法实现其免疫效果。本发明还证实了在UL56基因3’端和L0RF5基因的位置插入外源抗原基因不但不影响鸭瘟病毒的免疫原性，而且能够实现外源抗原的大量表达，因此，本发明提供的减毒的鸭瘟病毒毒株还可以通过插入外源的抗原基因，用于制备基因工程活载体疫苗。[0024]因此，另一方面，本发明提供了在制备鸭瘟疫苗或重组活病毒载体疫苗中的应用，所述鸭瘟疫苗为鸭瘟单苗或鸭瘟联合疫苗。[0025]优选的，所述在重组活病毒载体疫苗中的应用为在所述鸭瘟病毒毒株的UL56基因3’端和L0RF5基因缺失的位置插入其它外源抗原基因。[0026]进一步地，本发明提供一种重组活病毒载体，其为本发明提供的鸭瘟病毒株减毒毒株。[0027]以及，一种鸭瘟病毒或重组活载体病毒疫苗，其包括所述的鸭瘟病毒毒株或在所述的鸭瘟病毒毒株中插入外源抗原编码基因制备的重组病毒毒株。[0028]优选的，所述的外源抗原编码基因为禽流感病毒HA基因、病毒性肝炎VPl基因、细小病毒VP3基因或鸭坦布苏病毒E蛋白基因。[0029]本发明首次发现鸭瘟病毒UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失能够减弱鸭瘟病毒的毒力，证明UL56基因3’端和或L0RF5基因与鸭瘟病毒的毒力相关。[0030]因此，本发明提供鸭瘟病毒UL56基因或UL56基因联合L0RF5基因在调控鸭瘟病毒毒力或制备疫苗中的应用，所述制备疫苗中鸭瘟病毒的UL56基因失活或UL56基因和L0RF5基因同时失活。[0031]优选的，所述UL56基因具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列或具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列；所述L0RF5基因具有如SEQIDNO.2所述的核苷酸序列或具有如SEQIDNO.2所述的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。[0032]本发明证明UL56基因或L0RF5基因与鸭瘟病毒的毒力相关，可以利用其抗原性制备单克隆抗体。[0033]因此，本发明还提供一种单克隆抗体，其对应的抗原表位含有UL56基因或L0RF5基因编码的氨基酸序列。[0034]以及，所述单克隆抗体在制备鸭瘟病毒检测试剂盒中的应用。[0035]本发明的有益效果在于：[0036]1本发明首次发现UL56基因3’端缺失和L0RF5基因缺失能够减弱病毒毒力，且保持良好的免疫原性，进而能够用于制备活疫苗或作为活病毒载体，制备基因工程活载体疫苗。[0037]2本发明提供的减毒的鸭瘟病毒毒株对鸭不具有致病性，且具有很好的免疫原性，能够实现100%的免疫保护。附图说明[0038]图1为重组鸭瘟病毒rDEVΔUL56-RFP在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达结果，图中的灰色区域为红色荧光蛋白表达产生的红色荧光。具体实施方式[0039]下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。[0040]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0041]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，使用的亲本毒株鸭瘟病毒CVCCAV1221株来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心;参见：中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，第二版，中国农业科学技术出版社，2002，pl384MD-I8T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程大连有限公司。[0042]实施例1鸭瘟病毒rDEVAUL56的构建[0043]IDEV基因组DNA的提取[0044]取鸭瘟病毒CVCCAV1221的病毒液437.5yL，加入蛋白酶K20mgmL12.5yL和10%SDS50yL;56°C水浴Ih;分别用酚、酚氯仿异戊醇（25:24:1、氯仿各抽提1次;取上清，加入110体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min;12000Xg离心IOmin，沉淀用70%乙醇洗涤1次，沉淀溶于30yL去离子水中，-20°C保存备用。[0045]2转移载体pT-UL56的构建[0046]以鸭瘟病毒CVCCAV1221基因组DNA为PCR扩增模板，以引物UA3F1SEQIDN0.10和UA3RlSEQIDN0.11扩增UL56基因（其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示）的上游1387bp片段，作为左同源臂SEQIDNO.3所示）。[0047]以引物DA3F1SEQIDNO.12和DA3R1SEQIDNO.13扩增UL56基因的下游1421bp片段（SEQIDN0.4所示），作为右同源臂。左、右同源臂分别经HindIII+PstI、KpnI+BamH頂每切后连接到pUC-18载体，构建相应的重组质粒pT-UL56。[0048]3同源重组[0049]按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL56与重组鸭瘟病毒rDEVΔUL56-RFP转染鸭胚成纤维细胞DEF。具体步骤如下：[0050]六孔板中的DEF培养至长成70%〜90%细胞单层时，接种适量的重组鸭瘟病毒rDEVAUL56-RFP，吸附1〜4小时;将Iyg转移载体pT-UL56稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50yL，室温孵育5min;取2yLLipofectamine2000与48yL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min;将50yLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50此质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入O.5mL无血清OPTI-MEM，将IOOyLLipofectamine2000DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37°C培养4h，弃去上清，加入10%胎牛血清的M199培养基，置37°C培养24h后，用1%胎牛血清的M199培养基换液，置37°C培养3〜5d。[0051]⑷重组病毒的蚀斑纯化[0052]将初步获得的重组病毒接种至已长成良好细胞单层的6孔板DEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1%的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48-72小时后在荧光显微镜下观察，挑选单个无荧光的蚀斑于〇.5mlMl99营养液中，冻融1次后接种6孔板DEF细胞，如此进行蚀斑纯化3〜4次，获得了缺失UL56基因3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp的重组鸭瘟病毒rDEVAUL56。[0053]实施例2鸭瘟病毒rDEVΔUL56-RFP的构建[0054]1转移载体pT-UL56-RFP的构建[0055]采用PCR方法，从质粒pEGFP-Cl购自Clontech公司）中扩增PCMVIE-EGFP-SV40polyA表达盒，克隆至pMD18T-simple载体。通过NheI和BamHI双酶切，用RFP代替EGFP，获得表达红色荧光的质粒pT-RFP。[0056]用組111酶切，电泳回收1^^表达盒（1.71^规〇10勵.5所示），插入到实施例1步骤2获得的PT-UL56重组质粒的Mlu頂每切位点，获得转移载体pT-UL56-RFP。[0057]表IpT-UL56-RFP的构建使用的引物[0059]2同源重组[0060]按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-UL56-RFP与鸭瘟病毒CVCCAV1221转染鸭胚成纤维细胞DEF。具体步骤如下：[0061]六孔板中的DEF培养至长成70%〜90%细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1〜4小时;将Ug转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50yL，室温孵育5min;取2yLLipofectamine2000与48yL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min;将50yLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50yL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入〇.5mL无血清0ΡΤΙ-ΜΕΜ，将IOOyLLipofectamine2000DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37°C培养4h，弃去上清，加入10%胎牛血清的M199培养基，置37°C培养24h后，用1%胎牛血清的M199培养基换液，置37°C培养3〜5d，每天观察，直至出现重组病毒荧光斑。[0062]3重组病毒的蚀斑纯化[0063]将初步获得的重组病毒接种至已长成良好细胞单层的6孔板DEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1%的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察红色荧光，挑选单个荧光蚀斑于0.5mlM199营养液中，冻融1次后接种6孔板DEF细胞，如此进行蚀斑纯化3〜4次，获得了表达红色荧光蛋白的重组鸭瘟病毒rDEVAUL56-RFP。该鸭瘟病毒毒株的UL56基因的3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp被RFP表达盒替换。[0064]重组病毒的荧光显微镜观察结果如图1所示，插入AUL56位点的红色荧光蛋白成功表达。[0065]实施例3重组鸭瘟病毒rDEVΔUL56-RFP的动物安全性实验[0066]将15只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射重组病毒rDEVAUL56-RFP，每只106'QTCID5Q;第2组肌肉注射鸭瘟病毒CVCCAV1221，每只104'QTCID5Q;第3组不接种，作为对照。每组单独隔离饲养。观察14d，每天记录发病死亡情况。结果鸭瘟病毒CVCCAV1221接种组在7d内全部死亡，而重组病毒免疫组和不接种对照组在Hd观察期内均全部健活，说明重组病毒rDEVΔUL56-RFP对鸭无致病性，可用于制备鸭瘟疫苗。[0067]实施例4重组鸭瘟病毒rDEVΔUL56-RFP的免疫原性评价[0068]将15只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射重组病毒rDEVAUL56-rfp，每只IO5Itcid5q;第2组肌肉注射商品化鸭瘟活疫苗，每只io5Acid5;第3组不免疫，作为对照组。每组单独隔离饲养。在免疫后14d，静脉采血、分离血清用于中和抗体效价测定，然后腿部肌肉注射接种DEV强毒CVCCAV1221，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况，攻毒对照组在攻毒后第4d开始发病，7d内100%死亡；重组病毒rDEVΔUL56-RFP和商品化鸭瘟活疫苗免疫组均全部健活，实现了100%的免疫保护;重组病毒rDEVΔUL56-RFP和商品化鸭瘟活疫苗免疫组中和抗体效价分别为1:24.5、1:23.3，对照组中和抗体效价低于1:4，说明rDEVΔUL56-RFP毒株具有良好的免疫原性。[0069]实施例5重组鸭瘟病毒活载体的构建[0070]1转移载体构建[0071]通过NheI和BamHI双酶切，用禽流感病毒HA基因（H9亚型如SEQIDNO.6所示、H5亚型如SEQIDNO.7所示）、病毒性肝炎VPl基因（如SEQIDNO.8所示）、细小病毒VP3基因如SEQIDNO.9所示）、鸭坦布苏病毒E蛋白基因（如SEQIDNO.10所示替换质粒pT-UL56-RFP中的RFP基因，获得含有外源抗原基因的重组转移载体。[0072]2同源重组[0073]按照1^?^6^11^1^了12000转染试剂盒说明书，将重组转移载体与重组鸭瘟病毒rDEVΔUL56-RFP转染鸭胚成纤维细胞DEF。具体步骤如下：[0074]六孔板中的DEF培养至长成70%〜90%细胞单层时，接种适量的重组鸭瘟病毒rDEVAUL56-RFP，吸附1〜4小时；将Iyg重组转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50yL，室温孵育5min;取2yLLipofectamine2000与48yL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min;将50yLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50此质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将IOOyLLipofectamine2000DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37°C培养4h，弃去上清，加入10%胎牛血清的M199培养基，置37°C培养24h后，用1%胎牛血清的M199培养基换液，置37°C培养3〜5d。[0075]3重组病毒的蚀斑纯化[0076]将初步获得的重组病毒接种至已长成良好细胞单层的6孔板DEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1%的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48-72小时后在荧光显微镜下观察，挑选单个无荧光的蚀斑于〇.5mlMl99营养液中，冻融1次后接种6孔板DEF细胞，如此进行蚀斑纯化3〜4次，获得了分别表达流感病毒HA基因、病毒性肝炎VPl基因、细小病毒VP3基因、鸭坦布苏病毒E蛋白基因的保护性抗原的重组鸭瘟病毒。[0077]实施例6重组鸭瘟病毒rDEVΔUL56-RFP用于疫苗制备[0078]1、疫苗制备[0079]⑴细胞制备[0080]选择发育良好的9〜11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。[0081]⑵病毒液的制备[0082]按体积比0.01%〜0.5%的接毒量将生产种毒rDEVΔUL56-RFP接种CEF细胞单层，37〜38°C培养36〜72小时，当病变率达75%以上收获病毒液，-20°C结冻保存。[0083]3半成品的检验[0084]①无菌检验:每组分别取样，按《中国兽药典》二〇一五年版三部进行。[0085]②病毒含量测定:保证每0.1ml病毒含量彡105'qTCID50。[0086]⑷配苗及分装[0087]将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5%蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。[0088]5冻干[0089]分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）附录437页迅速进行冷冻真空干燥。[0090]2、疫苗检验[0091]本发明涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版（三部），中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》）的方法进行。[0092]1性状:淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。[0093]2无菌检验:按《中国兽药典》进行检验。[0094]3支原体检验:按《中国兽药典》进行检验。[0095]⑷外源病毒检验:按《中国兽药典》进行检验。[0096]5鉴别检验:将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID5Q0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60分钟后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔48孔细胞板），每孔0.2ml，同时设病毒对照组，置37〜38°C条件下，培养观察120小时。[0097]6安全检验：用2〜4周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日。[0098]⑺效力检验:下列方法任择其一。[0099]①病毒含量测定:按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔96孔细胞培养板），每孔0.Iml，置37〜38°C条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID5Oo[0100]②用鸭检验：用2〜8周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗I羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD鸭瘟病毒强毒CVCCAV1221，观察14日。[0101]⑻剩余水分测定:按《兽药典》规定方法进行测定。[0102]⑼真空度测定:按《兽药典》规定方法进行测定。[0103]对制备的鸭瘟病毒疫苗进行性状、纯净性、安全性和免疫效力的检验，结果表明，制备的鸭瘟病毒疫苗的性状、剩余水分和真空度符合《中国兽药典》的规定，并且没有细菌、支原体和外源病毒的污染;鸭瘟病毒特异性鉴定实验中，病毒对照组全部出现病变，抗体中和组没有出现细胞病变;将疫苗接种易感鸭，经14天饲养，全部健活;疫苗免疫效力检验中，接种鸭瘟病毒强毒后14天，对照鸭4只死亡，免疫鸭8只健活，表明该鸭瘟病毒疫苗能够对鸭瘟病毒实现较高的免疫效力。[0104]实施例7单克隆抗体制备[0105]UL56基因3’端和L0RF5基因与鸭瘟病毒的毒力相关，因此，本领域技术人员可以利用UL56基因3’端和L0RF5基因制备抗鸭瘟病毒的单克隆抗体。具体步骤可采用单克隆抗体制备的常规技术：（1免疫原的制备:利用大肠杆菌表达UL56基因3’端或L0RF5基因；（2动物免疫:利用表达的蛋白免疫BALBc健康小鼠，采集小鼠脾脏；（3杂交瘤细胞的制备:骨髓瘤细胞与脾细胞融合，筛选阳性细胞株；（4杂交瘤细胞系的建立:重复步骤3，筛选得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。[0106]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种减毒的鸭瘟病毒毒株，其特征在于，所述鸭瘟病毒毒株的UL56基因失活或UL56基因和L0RF5基因同时失活;优选的，所述失活为缺失UL56基因3’端60bp和L0RF5基因5’端2638bp〇2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒毒株，其特征在于，所述鸭瘟病毒毒株的UL56基因3’端缺失的同时L0RF5基因失活，并插入外源基因，优选的，所述插入外源基因为在UL56基因3’端60bp缺失和L0RF5基因5’端2638bp缺失的位置插入外源基因。3.权利要求1〜2任意一项所述的鸭瘟病毒毒株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：⑴构建UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活，或UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活并插入外源基因的转移载体；2将步骤（1获得的转移载体和鸭瘟病毒亲本毒株共转染至宿主细胞中，经同源重组，筛选得到UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活，或UL56基因3’端缺失和L0RF5基因失活并在该位置插入外源基因的鸭痕病毒毒株。4.权利要求1〜2任意一项所述的鸭瘟病毒毒株在制备鸭瘟疫苗或重组活病毒载体疫苗中的应用，所述鸭瘟疫苗为鸭瘟单苗或鸭瘟联合疫苗。5.—种重组活病毒载体，其为权利要求1〜2任意一项所述的鸭瘟病毒株。6.—种鸭瘟病毒或重组活载体病毒疫苗，其特征在于，包括权利要求1〜2任意一项所述的鸭瘟病毒毒株或在权利要求1〜2任意一项所述的鸭瘟病毒毒株中插入外源抗原编码基因制备的重组病毒毒株;优选的，所述的外源抗原编码基因为禽流感病毒HA基因、病毒性肝炎VPl基因、细小病毒VP3基因或鸭坦布苏病毒E蛋白基因。7.鸭瘟病毒UL56基因或UL56基因联合L0RF5基因在调控鸭瘟病毒毒力或制备疫苗中的应用，其特征在于，所述制备疫苗中鸭瘟病毒的UL56基因失活或UL56基因和L0RF5基因同时失活。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述UL56基因的序列如SEQIDNO.1所示，所述L0RF5基因的序列如SEQIDNO.2所示。9.一种单克隆抗体，其特征在于，其对应的抗原表位含有UL56基因或L0RF5基因编码的氨基酸序列。10.权利要求9所述的单克隆抗体在制备鸭瘟病毒检测试剂盒中的应用。

百度查询： 中国兽医药品监察所 鸭瘟病毒UL56基因3’端缺失和LORF5基因缺失突变株及其构建方法与应用