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摘要：本发明公开了一种根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法。本发明通过优化不同外植体取材条件、取材时间和预培养时间，获得最适于侵染的各类外植体材料；通过比较侵染菌液加入不同附加物后的侵染效果，筛选最佳侵染菌液；通过在共培养阶段比较不同看护培养液对侵染效果的影响，筛选最佳共培养方案；通过控制选择脱分化培养和选择再分化培养阶段的光照条件，培养基成分和培养基更换频率等，提高遗传转化效率。本发明整体目标在于构建了一套稳定高效的根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系。为梨属植物的遗传转化和基因编辑研究奠定。该方法可应用于梨基因编辑技术、基因功能和新种质创制研究等。

主权项：1.一种根癌农杆菌介导杜梨遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：1）杜梨叶片和叶柄外植体的获得：2）叶片外植体的预培养：将灭菌好的脱分化培养基分装至培养皿中，放一张灭菌滤纸在脱分化培养基上，将叶片外植体放至灭菌滤纸上且叶片外植体近轴面朝上，置于25±3℃暗培养3-4d后备用；3）叶柄外植体的预培养：将灭菌好的脱分化培养基分装至培养皿中，放一张灭菌滤纸在脱分化培养基上，将叶柄外植体平放，置于25±3℃暗培养6-8d后备用；4）侵染菌液的制备：于外植体侵染前3-4d，挑取活化好携带有目的基因的根癌农杆菌单菌落，接种至含20-60mgLkan和20-60mgLrif的LB液体培养基中，置于恒温摇床上25±3℃培养至农杆菌浓度为OD600=0.7-0.9；取菌液加入到LB培养基中培养3-5h，离心，倒去上清液，用LB液体培养基重悬，调整菌液OD600=0.4-0.6，加入0.001-0.003%表面活性剂L-77和45-55mgLAS，置于恒温摇床25±3℃培养1-3h后，获得侵染菌液，备用；5）共培养看护培养液的制备：于外植体侵染前，取增殖培养20-30d的矮牵牛组培苗厚实嫩叶，取嫩叶置于灭菌研磨中，加入研磨液研磨成汁，再加入0.001-0.003%表面活性剂L-77和45-55mgLAS研磨混匀后，备用；6）侵染：在侵染菌液中加入表面活性剂L-77，将制备好的侵染菌液倒入无菌培养皿中，将完成预培养的外植体转入侵染菌液，侵染20-45min后，将外植体转至灭菌滤纸上，吸除表面菌液，然后将外植体转至表面覆盖有灭菌滤纸的共培养基上，再用一张新的灭菌滤纸吸附共培养看护培养液后覆盖至外植体上方，获得共培养外植体；7）共培养：将共培养外植体，置于25±3℃暗培养2-4d后，经除菌清洗、选择培养脱分化培养阶段、选择培养再分化培养阶段、增殖培养、生根培养和炼苗移栽，即得。

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