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申请/专利权人：江苏姜曲海猪种业有限公司;江苏农牧科技职业学院
摘要：本发明提供了一种猪YBX3基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、设计sgRNA向导序列，分别为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3；S2、在5’端添加额外碱基CACC；S3、阳性敲除质粒混合电转入IPEC‑J2细胞系并进行药筛，提取YBX3敲除细胞DNA，使用T7EndonucleaseI酶将PCR产物酶切，同时进行PCR的扩增测序，验证sgRNA效率；S4、选择转染高效率sgRNA的IPEC‑J2进行有限稀释法筛选；S5、RT‑qPCR检测PEDVM基因的表达差异。本发明成功建立猪YBX3基因敲除的IPEC‑J2细胞系，CRISPRCas9敲除技术比起干扰、基因沉默等技术手段更有效果，能够有助于研究YBX3在猪抗病育种中的功能。
主权项：1.一种猪YBX3基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、通过在线软件网址设计sgRNA向导序列，分别为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3；S2、在5’端添加额外碱基CACC，若sgRNA5’端无碱基G，则额外添加碱基G，反向互补序列添加额外碱基AAAC，退火后形成dsDNA；退火后dsDNA进行酶切，并连接至线性化PGK1.2载体，得到连接产物，后续进行PCR测序挑选阳性克隆并扩大培养，提取质粒得到阳性敲除质粒；S3、阳性敲除质粒混合电转入IPEC-J2细胞系并进行药筛，提取YBX3敲除细胞DNA，使用T7EndonucleaseI酶将PCR产物酶切，同时进行PCR的扩增测序，验证sgRNA效率；S4、选择转染高效率sgRNA的IPEC-J2进行有限稀释法筛选，挑选单克隆细胞，扩大培养后经PCR测序和Westernblot验证成功筛选得到YBX3基因敲除细胞系；S5、YBX3敲除细胞系和对照组细胞提取RNA，反转录后使用RT-qPCR检测PEDVM基因的表达差异。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 江苏姜曲海猪种业有限公司 江苏农牧科技职业学院 一种猪YBX3基因敲除细胞系的构建方法及其应用
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