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申请/专利权人：吉林农业大学

摘要：本发明公开了一种新城疫病毒双质粒拯救系统及其构建方法、鉴定方法与应用，先基于CMV启动子构建新城疫病毒LaSota株全基因组cDNA克隆质粒，然后构建可同时表达NP、P、L蛋白的多启动子单辅助质粒pCI‑NPL，最终建立了双质粒病毒拯救系统，并成功产生了具有感染性的新城疫子代病毒颗粒。基于EGFP报告基因进行拯救效率评价的结果显示，双质粒系统的拯救效率更高。此外通过血凝效价、EID50、MDT、ICPI、IVPI检测结果表明，重组病毒rLaSota和rLaSota‑EGFP具有与亲本野生型毒株相似的生物学特性，为新城疫病毒及其他负链RNA病毒构建更加简便、高效的拯救系统提供新的思路。

主权项：1.一种新城疫病毒双质粒拯救系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、新城疫病毒LaSota株基因组全长克隆质粒pCI-LaSota构建：根据新城疫病毒LaSota株基因组序列，将全基因组分为5个末端部分重叠的基因片段并进行分段克隆，利用相邻片段重叠部分的限制性酶切位点体外拼接为完整NDVLaSota株基因组全长cDNA，并分别在5’端和3’端分别引入锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列，克隆于真核表达载体pCI中，构建为pCI-LaSota，其核苷酸序列如SEQNo.1所示；其中，新城疫病毒LaSota株基因组先通过PCR定点突变，将3155-3162nt序列突变为PmeⅠ限制性酶切序列，再根据基因组内酶切位点PmeⅠ、XbaⅠ、BsiWⅠ、StuⅠ将LaSota基因组分为五个基因片段，五个基因片段的扩增产物分别为3216bp、3014bp、2680bp、3985bp、2437bp片段；五个基因片段F1-F5所用引物序列如SEQNo.3～SEQNo.14所示；在锤头状核酶序列上游引入MluⅠ限制性酶切位点，在丁型肝炎病毒核酶序列下游引入NotⅠ限制性酶切位点，利用MluⅠ和NotⅠ酶切位点将整个基因组连入pCI真核表达载体CMV启动子下游MluⅠ和NotⅠ位点之间，构建得到基因组全长质粒pCI-LaSota；S2、辅助质粒PCI-NPL构建：以步骤S1中的cDNA为模板，分别扩增NP、P和L基因，并融合启动子CMV和PolyA信号，构建为可共表达NP、P、L蛋白的三启动子辅助质粒PCI-NPL，其核苷酸序列如SEQNo.2所示；其中，以步骤S1中的cDNA为模板分别扩增NP、P基因的CDS区，根据L基因内XmaⅠ限制性酶切位点将L基因分为两段L1和L2扩增，并在各基因CDS区上游引入Kozak序列GCCACC；NP和P基因两端均分别引入NheⅠ和NotⅠ酶切位点，L基因两端分别引入XbaⅠ和NotⅠ酶切位点；将扩增的NP、P和L基因分别连接至pCI表达载体多克隆位点上，记为pCI-NP、pCI-P、pCI-L；再将NP、P基因分别与PolyA相连，得到NP-PolyA和P-PolyA，通过融合PCR的方法分别将CMV部分连接至NP-PolyA和P-PolyA的3’末端，组合成NP-PolyA-CMV和P-PolyA-CMV结构；NP-PolyA-CMV结构上游引入MluⅠ酶切位点、下游引入SacⅡ酶切位点，P-PolyA-CMV结构上游引入SacⅡ酶切位点，下游引入XbaⅠ酶切位点，使用相应限制性核酸内切酶消化，通过T4连接酶将NP-PolyA-CMV结构和P-PolyA-CMV结构依次连接到pCI-L载体MluⅠ、SacⅡ、XbaⅠ之间，构建成三启动子辅助质粒pCI-NPL；S3、双质粒拯救系统的构建：采用磷酸钙法将新城疫病毒LaSota株基因组全长克隆质粒pCI-LaSota和辅助质粒PCI-NPL按2:1的比例共转染BHK-21细胞，5天后收获转染细胞上清，接种于SFP鸡胚尿囊腔，收获病毒尿囊液经过HA试验检测结果阳性者记为rLaSota保存；双质粒拯救系统的构建方法为：取5μgpCI-LaSota、2.5μgpCI-NPL和9μL2MCaCl2溶液加入1.5ml离心管中，以无菌H2O补至75μL，颠倒混匀，少量多次逐步转入75μL的2×HepesBufferedSaline中；全部混合后静置20min，加入BHK-21六孔细胞板中，使转染混合物均匀分布在细胞表面，细胞于5％CO2、37℃培养箱培养3h后置于42℃水浴锅中热激2h，继续于细胞培养箱培养；转染24h后弃培养基，加入含10％DMSO的PBS缓冲液进行细胞休克，2.5min后弃液，加入完全DMEM培养液继续温箱内培养；转染48h后换成无血清DMEM并加入TPCK胰酶至终浓度为1μgmL；转染96h后收获细胞上清，0.22μM滤器过滤后接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔；120h后收取鸡胚尿囊液进行血凝试验，将鸡胚尿囊液进行21-211倍稀释加入96孔V型血凝板中，50μL孔，再加入1％鸡红细胞，50μL孔，静置30min后观察发现，21-27稀释度样品出现红细胞凝集现象，而接种正常细胞上清液的鸡胚尿囊液观察到红细胞呈泪滴状流淌，试验结果阳性者，重组新城疫病毒血凝效价达7log2，记为rLaSota。

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