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特异性核酸探针、核酸富集法及形成的沙门氏菌检测方法 

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申请/专利权人:甘肃省科学院传感技术研究所

摘要:一种特异性核酸探针、核酸富集法及形成的沙门氏菌检测方法,特异性核酸探针由沙门氏菌Inva基因设计合成,包括5'端修饰氨基用于连接羧基磁珠的捕获探针和3'端修饰TAMRA‑N用于信号检测的检测探针,其中捕获探针3'端和检测探针5'端分别跟待测沙门氏菌特定核酸序列结合形成磁性探针‑待测核酸片段‑检测探针的复合物;待测核酸片段由建立的可放大信号的核酸富集纯化技术提取富集,最后通过检测荧光强度以及标准曲线得到沙门氏菌浓度,达到特异性定量检测沙门氏菌的目的。本发明提供的沙门氏菌检测方法无需增菌,具有高特异性,高灵敏度,可检测实际样品(复杂环境)中微量沙门氏菌,提高了检测灵敏度,同时提高了检测效率。

主权项:1.一种非疾病诊断和治疗为目的的沙门氏菌检测方法,其特征在于,它包括如下步骤:(1)将合成的捕获探针溶于水中形成浓度为100mM的捕获探针溶液待用;该捕获探针序列5'端标记有氨基NH2,其序列为5'-NH2-TTTTTTTGGTTGTTACGGCTATTC-3';(2)将羧基磁珠分散于磷酸盐缓冲液PBS,加入步骤(1)中所述捕获探针溶液,37℃孵育反应后磁分离弃上清,得到负载特异性核酸探针的磁性探针;(3)细菌培养液微孔滤膜过滤,分散于裂解缓冲液,加入10μL蛋白酶K,37℃反应15min,得到裂解培养液;(4)裂解培养液依次分别加入内切酶室温静置反应5min,得到待测样品核酸片段,所述内切酶包括HindIII和EcoRI;(5)在所述待测样品核酸片段中加入磷酸盐缓冲液PBS混悬,然后加入步骤(2)所得的磁性探针,混匀后静止15min,所述捕获探针3'端和待测沙门氏菌的核酸序列:Inva基因序列3’…TAACCAACAATGCCGATAAGACTGG…5’结合,得到混悬液待用;(6)在步骤(5)混悬液中加入检测探针,该检测探针序列3'端标记有荧光素TAMRA-N,其序列为5'-ATGCTGTTATCGCTCACGTTTTTTT-TAMRA-N-3';混匀后静置30min,所述检测探针5'端和待测沙门氏菌的核酸序列:Inva基因序列3’…ATGTTACGACAATAGCGAGTGCGGGA…5’结合;磁分离弃上清,用磷酸盐缓冲液PBS充分洗涤,得到磁性探针-待测核酸片段-检测探针复合物,将其转移至石英比色皿中,检测其在580nm处的荧光强度;(7)与沙门氏菌浓度的标准曲线进行对比,计算待测样品中沙门氏菌的浓度。

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权利要求:

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