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申请/专利权人：皖南医学院

摘要：本发明公开了一种IRE1‑XBP1信号促进肺癌化疗耐药的方法，肌醇调节激酶1IRE1是一种内质网ER常驻跨膜蛋白，可感知ER应激并介导未折叠蛋白反应UPR的重要环节，IRE1通过激活x‑box结合蛋白1XBP1，上调多种ER伴侣的表达，从而降低ER应激；越来越多的证据表明，IRE1‑XBP1轴在致癌转化和癌症发展过程中起着多用途信号传感器的作用；本发明中探讨了IRE1‑XBP1信号如何促进肺癌的化疗耐药；在本发明中表明，IRE1α‑XBP1途径的激活导致耐多药相关蛋白1MRP1表达增加，从而促进药物外排并赋予细胞毒性化疗的抗性；在分子水平上，xbp1诱导的c‑Myc是SREBP1表达所必需的，SREBP1结合MRP1启动子直接调控其转录；本发明研究结果表明，IRE1α‑XBP1在化疗耐药中起重要作用，是肺癌新的预后标志物。

主权项：1.一种IRE1-XBP1信号促进肺癌化疗耐药的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、细胞培养：将癌细胞在DMEMHyclone，Logan，UT，USA中培养，添加10％胎牛血清FBS，GibcoBRL，GrandIsland，NY，USA；将癌细胞接种于六孔板中每孔10-5个细胞，培养至70％合流，然后按照制造商的说明使用PolyJetDNA转染试剂SignaGen实验室，Gaithersburg，MD，USA转染质粒；S2、MTT测定：采用3-4，5-二甲基噻唑-2-基-2.5-二苯基溴化四氮唑MTT测定细胞活力，在指定的处理后，细胞进行PBS洗涤；洗涤后的癌细胞在含有MTT溶液0.5mgmL的新鲜培养基中，在37℃的温度下孵育4小时，用DMSO溶解所得的甲酰胺晶体，并使用BioTekcitation5平板阅读器BioTek,Winooski,VT，USA在570nm波长处测量吸光度；S3、免疫印迹：细胞处理后，使用加热的Laemmli样品缓冲液刮擦和均质，所得匀浆然后使用SDS-PAGE分离，随后转移到硝化纤维素NC膜上GEHealthcare，Piscataway，NJ，USA；在应用不同的抗体进行检测后，信号被捕获并使用化学发光系统AI680ProteinSimple,SanJose,CA，USA；S4、双荧光素酶报告基因测定：报告基因构建与Renilla荧光素酶载体一起共转染到细胞环境中；随后，利用双荧光素酶报告检测系统Promega确定萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶的表达水平；S5、定量实时RT-PCR分析：细胞处理后，采用TrizorInvitrogen，沃尔瑟姆，USA提取方法分离细胞RNA；随后，利用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒TaKaRaBio，大连，中国逆转录成互补DNAcDNA；TBGreenMasterMix采购自AppliedBiosystems,ThermoFisherScientific，MA沃尔瑟姆，USA在罗氏LightCycler96平台罗氏，瑞士上进行荧光检测；S6、Hoechst33342外排测定：将细胞置于TG30nM处理12小时，开始实验；随后，用1xPBS溶液彻底清洗细胞，并用新鲜Hoechst培养基10μgml代替现有培养基；细胞在37℃培养箱中进一步孵育20分钟；在此孵育后将钙通道阻滞剂维拉帕米10μM引入实验装置，随后继续孵育10分钟；荧光强度评估采用BioTekcitation5系统由BioTek公司生产，Winooski,VT，USA；S7、克隆和DNA构建：SREBP1启动子从HindIII和KpnI位点插入PGL3-BASICPromega,Madison,WI，USA荧光质粒；利用重叠PCR延伸技术的位点特异性诱变将点突变引入SREBP1启动子中，以最长的SREBP1启动子作为模板；S8、统计分析：采用方差分析进行统计评估方差分析通过GraphPadPrism6GraphPad软件公司，SanDiego,CA，USA。

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