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申请/专利权人：东北农业大学;内蒙古草业技术创新中心有限公司

摘要：本发明提供一种鉴定车轴草的方法及其试剂盒与应用，属于生物领域，解决了对车轴草的精准鉴定与区分困难的问题，本发明利用DNA条形码：ITS2、psbA‑trnH、rbcL和matk设计四种引物对如SEQIDNO：1‑8所示，对基因组DNA进行PCR扩增和测序，根据特定位点碱基序列进行物种鉴定与区分，所述的车轴草属为红三叶、白三叶、地三叶、高加索三叶草、杂三叶、野火球。本发明实现了对车轴草属的精准鉴定与区分，具有鉴定方法简单、快速、效率高、重复性好的优点。

主权项：1.一种鉴定车轴草属内不同植物物种的方法，所述的车轴草属为红三叶、白三叶、地三叶、高加索三叶草、杂三叶、野火球，其特征在于，鉴定方法步骤如下：S1、从待测样品中提取基因组DNA；S2、以待测样品的基因组DNA为模板，利用DNA条形码引物组：如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示引物进行PCR扩增matk序列片段；利用DNA条形码引物组：如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示引物进行PCR扩增rbcL序列片段；利用DNA条形码引物组：如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示引物进行PCR扩增ITS2序列片段，利用DNA条形码引物组：如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示引物进行PCR扩增psbA-trnH序列片段；S3、得到扩增产物，经过测序、校对、特征比对，对扩增后的目标DNA条形码序列构建进化树；S4、确定待检测样品的物种：若ITS2基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：9所示，在第263位碱基型为G，则判定该物种为红三叶；若ITS2基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：10所示，在第160位碱基型为T，则判定该物种为白三叶；若ITS2基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：11所示，在第156位碱基型为A，则判定该物种为地三叶；若ITS2基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：12所示，在第80位碱基型T，则判定该物种为高加索三叶草；若ITS2基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：13所示，在第97位碱基型为A，则判定该物种为野火球；若ITS2基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：14所示，在第218位碱基型为A，在第188位碱基型为C，则判定该物种为杂三叶；若psbA-trnH基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：15所示，在第22位碱基型为G，则判定该物种为红三叶；若psbA-trnH基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：16所示，在第27位碱基型为C，则判定该物种为白三叶；若psbA-trnH基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：17所示，在第214位碱基型为C，则判定该物种为地三叶；若psbA-trnH基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：18所示，在第121位碱基型为A，则判定该物种为杂三叶；若psbA-trnH基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：19所示，在第100位碱基型为T，则判定该物种为野火球；若matk基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：20所示，在第39位碱基型为A，则判定该物种为红三叶；若matk基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：21所示，在第47位碱基型为C，则判定该物种为白三叶；若matk基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：22所示，在第375位碱基型为C，则判定该物种为地三叶；若matk基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：23所示，在第6位碱基型为C，则判定该物种为高加索三叶草；若matk基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：24所示，在第255位碱基型为G，则判定该物种为杂三叶；若matk基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：25所示，在第530位碱基型为C，则判定该物种为野火球；若rbcL基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：26所示，在第4位碱基型为T，则判定该物种为红三叶；若rbcL基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：27所示，在第54位碱基型为G，则判定该物种为白三叶；若rbcL基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：28所示，在第348位碱基型为A，则判定该物种为地三叶；若rbcL基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：29所示，在第283位碱基型为C，则判定该物种为高加索三叶草；若rbcL基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：30所示，在第72位碱基型为C，则判定该物种为杂三叶；若rbcL基因片段的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQIDNO：31所示，在第108位碱基型为T，则判定该物种为野火球。

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