申请/专利权人：北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院)

申请日：2024-03-15

公开（公告）日：2024-07-05

公开（公告）号：CN117887820B

主分类号：C12Q1/6841

分类号：C12Q1/6841;C12Q1/682;G01N33/68

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.07.05#授权;2024.05.03#实质审查的生效;2024.04.16#公开

摘要：本发明属于生物检测领域，具体的，一种同时原位荧光检测RNA、DNA、蛋白质的方法。本发明采用TSA信号放大系统（TSA染料）让RNA‑FISH和蛋白免疫荧光的信号可以在DNA‑FISH实验过程的高温和强酸（胃蛋白酶消化步骤）环境中保留，从而保留原来的RNA和蛋白信号，实现同时原位荧光检测人类RNA、DNA、蛋白质。具有广阔的应用前景。

主权项：1.一种同时原位荧光检测RNA、DNA和蛋白质的方法，其特征在于，所述RNA、DNA和蛋白质来自人类或其他哺乳动物的组织或细胞样品，所述方法包括如下步骤：（1）样本制备：包括将样品制备为石蜡切片、冰冻切片、贴壁或悬浮细胞；（2）样本预处理；（3）一抗孵育；（4）RNA-FISH和RNA探针的TSA染色；（5）HRP偶联的二抗孵育和二抗的TSA染色；（6）转接DNA-FISH的前处理；（7）DNA-FISH探针杂交；（8）DNA-FISH洗片和DAPI复染；（9）RNADNA蛋白共同荧光成像；其中，所述步骤（1）包括：（A）对于组织：获得组织后，先福尔马林固定，对组织进行石蜡包埋和OCT包埋，实验前新鲜制备石蜡切片或冰冻切片；（B）对于细胞：贴壁细胞直接培养在用于细胞培养的载玻片上，然后福尔马林固定后进行后续实验，或者消化为细胞悬液，经福尔马林固定后进行细胞涂片；对于悬浮细胞，直接将细胞用福尔马林固定，然后稀释成所需的浓度进行细胞涂片；所述步骤（2）包括：（A）对于石蜡切片，在烤片机上60℃烤片30分钟，然后在二甲苯中浸泡两个5分钟；对于冰冻切片或细胞涂片，在摇床上用PBS洗4次，每次5分钟；（B）在无水乙醇中浸泡2分钟，在第二个无水乙醇中重复上述浸泡2分钟的步骤，然后在通风橱内干燥载玻片；（C）在每个组织块滴加1-2滴RNAscope®双氧水，在室温下孵育10分钟，然后蒸馏水清洗；（D）用镊子将载玻片架浸没到沸腾的1X共检测靶标修复试剂中，处理10-20分钟；（E）立即将热载玻片架转移到盛有蒸馏水的清洗槽中，将载玻片架在蒸馏水中上下移动3-5次，每次换新鲜的蒸馏水；（F）用1XPBST清洗载玻片，将载玻片架在1XPBST中上下移动3-5次;所述步骤（3）包括：（A）制备一抗工作液，根据组织大小，滴加30-100μl的一抗工作液；（B）4℃过夜孵育;所述步骤（4）包括：（A）将载玻片浸入4%多聚甲醛中孵育，然后用PBST清洗载玻片；（B）在每个组织块上滴加1-2滴蛋白酶，在杂交炉内40℃孵育30分钟；（C）蛋白酶处理结束后，将载玻片用新鲜蒸馏水清洗两次，每次2分钟；（D）去除载玻片上多余的液体，滴加20-50μL探针混合物，完全覆盖样本，40℃孵育2小时；（E）用清洗缓冲液在室温下清洗载玻片；（F）滴加1-2滴信号放大试剂AMP1，40℃孵育30分钟，然后用清洗缓冲液在室温下清洗载玻片；（G）按上述步骤依次进行AMP2和AMP3的孵育，其中AMP3孵育15分钟即可；（H）根据RNA探针所用的通道在载玻片上滴加1-2滴对应通道的RNASCOPE®HRP-C1HRP-C2HRP-C3，40℃下孵育15分钟，清洗缓冲液在室温下清洗载玻片；（I）根据需要，在载玻片上滴加1-2滴染料工作液，40℃下孵育30分钟，清洗缓冲液在室温下清洗载玻片，此处选用TSA染料；（J）去除载玻片上多余的液体，滴加1-2滴多通道二代荧光HRP阻断剂，完全覆盖样本，40℃下孵育15分钟，清洗缓冲液在室温下清洗载玻片；（K）如果有多个不同通道的RNA探针，按通道重复（H）-（J）即可；所述步骤（5）包括：（A）加入经RNAscope®共检测抗体稀释液稀释的HRP偶联二抗，使其完全覆盖组织，在室温下孵育载玻片30分钟，用PBST清洗载玻片；（B）加入20-50μlOpal染料工作液，该TSA染料与RNA探针所用染料的激发波长和发射波长区分开，使其完全覆盖组织，在室温下孵育10分钟，用PBST清洗载玻片;（C）去除载玻片上的多余液体，滴加共检测封闭液，使其完全覆盖组织，40℃孵育15分钟，用PBST清洗载玻片；所述步骤（6）包括：（A）将载玻片置于固定液中室温固定10分钟，固定液为甲醇：冰醋酸=3:1；（B）65℃烤片机上避光烤片30分钟；（C）将载玻片浸入2XSSC洗5分钟；（D）在37℃下胃蛋白酶处理8分钟，再用2XSSC洗5分钟；（E）将载玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟，然后晾干；所述步骤（7）包括：（A）DNA探针杂交：用商品化的DNA探针或者定制的DNA探针，按探针:缓冲液=1:9配制，根据组织大小滴加4-10μl探针工作液，用盖玻片轻轻覆盖，周围用封片胶封好，在杂交仪上76℃9分钟，然后降温至42℃，（B）将片子取出，平放在湿盒中，在37℃-42℃孵育16小时以上;所述步骤（8）包括：（A）取出载玻片，小心揭掉封片胶，置于2×SSC中1-2分钟，用镊子小心移除盖玻片，再在2×SSC中洗5分钟；（B）浸入已在69℃水浴锅中平衡好的0.3%NP-400.4×SSC洗90秒；（C）室温下在0.1%NP-402×SSC中洗1分钟；（D）将载玻片依次在70%、85%、100%乙醇中处理2分钟，然后晾干；（E）滴加即用型DAPI溶液，处理40秒，然后用抗荧光淬灭剂封片。

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