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申请/专利权人：广州中医药大学第一附属医院

摘要：本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种BMSCs成骨化的诱导组合物、培养基和诱导方法。所述的组合物的有效成分由BMP2和阿魏酸组成，所述的组合物中BMP2的浓度为1×10‑4mgL；所述的阿魏酸的浓度为6.4×10‑4molL；该组合物可以显著的提高诱导效果，相比于单一的阿魏酸、BMP2，其诱导效果更好。

主权项：1.一种BMSCs成骨化的诱导组合物，其特征在于，所述的组合物的有效成分由BMP2和阿魏酸组成，所述的组合物中BMP2的浓度为1×10-4mgL；所述的阿魏酸的浓度为6.4×10-4molL。

全文数据：一种BMSCs成骨化的诱导组合物、培养基和诱导方法技术领域本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种BMSCs成骨化的诱导组合物、培养基和诱导方法。背景技术骨是一种特殊的结缔组织，由骨质、骨膜、骨髓、神经、血管及软骨构成。与软骨和其附属结构组成了骨骼系统，具有维持体型、对肌肉起支持和附着作用、保护邻近器官和内脏的功能1。骨骼系统除了保护和运动等相关功能外，在骨代谢相关激素调解下，还可通过储存和释放钙、磷等矿物质离子，维持机体的内环境稳态。骨由胚胎时期的间充质分化而来，主要起源于三种胚胎细胞系:颇骨起源于神经嵴细胞；中轴骨来源于体节的生骨节细胞，附肢骨来源于侧边面中胚层细胞。骨发生的方式一般分为膜内成骨与软骨成骨两种。通过膜内成骨形成的骨器管有肩胛骨、锁骨、颅盖骨、面股等；而软骨内成骨形成的骨器管包含颅腔基底的骨器管、脊椎、盆腔骨等。在一些骨骼发育的过程中，这两种的骨的发生过程是同时参与的，但是他们的区别在于膜内成骨的过程中不需要软骨原基。骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关，而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用。随着现代社会的经济发展，人们的生活节奏的加快，精神压力的增大，饮食习惯的改变，食物中各种添加剂的增加，使骨质疏松症osteoporosis，OP发病人数有逐年上升的趋势。虽然OP患者不直接危及生命，但OP患者在轻微外力作用下容易导致骨折、致残、致畸或死亡等不良后果，致使无数患者承受肉体和精神上的巨大痛苦，经济上的巨大压力，因此OP已成为影响老年人生活质量的主要因素之一。骨质疏松症osteoporosis，OP是一种中老年人的常见疾病，中年女性尤甚。据国际骨质疏松基金会统计，34％的绝经期妇女，20％的老年男性会发生骨质疏松症。2011年国是内流行病学报道我国约2.1亿人口处于低骨量的状态，受到越来越多人的关注。我院在中医治疗OP方面，有多年临床实践的使用经验。中医治疗OP，主要以补肾、活血、补气血、强筋健骨中药治疗，常用中药有当归、川芎、杜仲、骨碎补等。其中当归具有补血活血的功效，广泛应用于骨质疏松症的治疗，并取得很好的效果。研究表明：阿魏酸是这一类中药材中的主要活性成分，具有促进成骨细胞增殖、矿化等作用，但其是否有防治OP的作用及其具体机制尚不清楚。目前现代医学对OP的发病机制尚未完全阐明，没有公认的特效治疗方案和治疗药物，并成为国内外药物领域研究的热点。OP发病与卵巢功能减退、雌激素水平下降等因素有关，导致骨形成与骨吸收偶联失衡，骨转换加速、成骨细胞活力下降、破骨细胞活力增加、骨密度降低、骨组织微细结构遭受破坏。引发的原因主要有老年性、中年妇女经绝期、内分泌性皮质醇增多症、甲状腺功能亢进症、糖尿病、妊娠、哺乳期、营养性缺乏、染色体异常、其他原因骨质减少等。西医化药用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物分为两大类，第一类为骨吸收抑制药，包括钙剂、维生素D及活性维生素D、降钙素、二磷酸盐、雌激素以及异黄酮；第二类为骨形成促进药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。但长期使用这些药物会有一定的毒副作用。寻找疗效可靠、毒副作用少的抗OP药物成为亟待解决的问题。中医中药根据骨质疏松症的临床表现，将OP在祖国医学中归属于“骨痿”范畴，即病变在骨，其本在肾。中药在治疗OP方面，有着历史悠久，疗效可靠、毒副作用少的特点，已成为近十多年OP研究的热点。中医治疗OP，主要以补肾、活血、补气血、强筋健骨中药治疗，常用中药有当归、川芎、杜仲、骨碎补等。其中当归具有补血活血的功效，在治疗OP时，不管在中成药处方还是门诊医生处方中都尤为常用，广泛应用于骨质疏松症的治疗，并取得很好的效果。随着研究的深入，BMSCs在OP发病过程中发挥的作用日益引起关注，其成骨分化能力的强弱可能是OP的发病机制之一。研究证实，经典的Wntβ-catenin信号通路在调控BMSCs向成骨细胞分化的过程中起到关键性作用。研究发现，补肾类中药对OP具有良好的治疗效果，并促进BMSCs向成骨细胞分化。例如，目前研究较多的中药--骨碎补Rhiqomadrynariae，作为补肾壮骨代表药物，其活性成分骨碎补黄酮已被证实可以促进体外BMSCs增殖，并促进其向成骨方向分化。阿魏酸FerulicAcid，FA是中药当归中主要的活性成分，具有促进成骨细胞增殖、矿化等作用，但其是否有防治OP的作用及其具体机制尚不清楚。有待进一步的研究观察，为科学合理使用中药提供依据。阿魏酸植物来源于伞形科植物当归学Angelicasinensis、阿魏FerulaassafoetidaL、川芎LigusticumchuanxiongHort等植物。阿魏酸能清除自由基，促进清除自由基的酶的产生，增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，来调节人体生理机能。当机体在遭受各种有害刺激时，自由基的产生和抗氧化处理自由基的能力失衡而产生对细胞的氧化损伤，即氧化应激Oxidativestress，OS。近年来OS作为OP的一个重要危险因素得到普遍关注，OP患者由于衰老、雌激素缺乏、糖尿病等多种因素，体内氧化应激水平增高，成骨细胞和骨细胞的凋亡增多，骨重建失衡，骨密度降低和骨微结构破坏，骨折风险增加，导致OP发病。因此，抗氧化应激药物可能是防治骨质疏松的新靶点。OP是由于钙的吸收减少，排泄增多或者是破骨细胞增多增强，溶骨占优，成骨基质形成减少。导致骨的代谢失衡，使骨的钙含量不断减少，致骨的脆性增加易发生骨折。因此诱导BMSCs成骨分化也是治疗OP的一个研究重点。骨髓间充质干细胞BMSCs是常用的研究细胞。骨髓间充质干细胞2是一种多潜能干细胞，可分化为多种组织细胞，其免疫原性弱，而且易于转染外源基因，是组织工程研究的热点载体细胞，在基因治疗及细胞治疗领域也展示了光明的前景。骨髓间充质干细胞作为基因治疗的理想靶细胞，具有高代谢活力，利于重组蛋白分泌等诸多生物学特性，在不同诱导条件下具有多向分化潜能，体外扩增能力强。为促使BMSCs持续向成骨细胞转化，必须保持其外界有成骨诱导剂的持续作用。目前被广泛用于细胞及组织多种疾病的替代治疗。BMP是在1963年由美国的MarshallR.Urist教授首先发现，是目前最常见的新骨形成调控因子之一，具有诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织形成的作用，主要由成骨细胞和瘤性成骨细胞分泌。相关实验研究结果表明，BMP不同浓度和剂量时对骨髓间充质干细胞诱导作用的方式不同，低剂量时BMSCs被诱导聚集在骨形成部位，起到间接促进骨形成；中剂量时使BMSCs直接分化成骨，成软骨细胞；大剂量可促进骨髓间充质干细胞的增殖。Wnt信号通路是Wnt基因调控的重要信号传导系统，Wnt信号通路以其启动蛋白为Wnt蛋白而命名，与细胞的分裂、生长、分化、凋亡密切相关。主要通路组成成员包括Wnt蛋白、Dishevelled蛋白、糖原合成酶激酶3β、β-catenin等蛋白。主要包括Wntβ-catenin信号通路，通路激活核内靶基因的表达；WntCa+通路，激活磷脂酶CPLC和蛋白激酶CPKC；Wnt细胞极性通路。Wntβ-catenin信号通路是主要经典的Wnt信号通路，相关研究证实Wntβ-catenin信号通路与骨髓间充质干细胞分化生长成骨有关。在骨组织中，Wnt信号通路是一个非常重要的调节成骨发生的通路。骨形成与骨吸收偶联失衡是骨质疏松症发病的病理基础。目前研究表明Wntβ-catenin信号通路在骨重建过程中发挥重要作用，激活Wntβ-catenin信号通路，从而促进骨髓间充质干细胞BoneMesenchymalStemCells，BMSCs向成骨分化，且抑制其分化为脂细胞和软骨细胞，促进成骨细胞的矿化，抑制成骨细胞的凋亡。在中药治疗OP领域，关于Wnt信号通路与OP之间关系的文件中，有关骨碎补治疗OP的实验研究，多集中在其促进BMSCs增殖、促进成骨分化及成骨相关基因的表达上，探讨骨碎补经Wntβ-catenin信号通路促进成骨分化的研究极少。随着生物技术的研究水平不断提高，对OP的治疗机制的认识也在不断改变。为了更好应用中药如当归等治疗OP，需要对这一类中药的治疗机制做进一步研究。为揭示中药当归抗OP的活性物质基础，为OP的治疗研究提供新的思路和线索，本文对阿魏酸对大鼠骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的影响，以及阿魏酸对Wntβ-catenin信号通路的调控作用，探讨阿魏酸防治OP的分子生物学影响，揭示中药当归抗OP的活性物质基础，为OP的治疗研究提供新的思路和线索。影响新骨形成研究较为深入的生物因子为骨形态发生蛋白BoneMorphogeneticProteins,BMPs,BMPs对骨原细胞的分化起决定性作用,是促进成骨的主要因子。BMPs家族成员较多,至今已有40多种BMP蛋白被成功地分离。其中BMP2是转化生长因子βTGF-β超家族中的多功能细胞因子,可在骨损伤局部及异位促进细胞增殖,提高其碱性磷酸酶活性,也是唯一能够单独在异位诱导成骨形成的信号分子,这使其在骨关节疾病特别是骨折、骨缺损的临床治疗中具有极大的潜在应用价值。研究表明BMP2是BMP家族成员中骨诱导作用最强的因子,大量实验也证实了将BMP2直接或通过载体局部应用可促进骨形成。现有技术均表明了BMP2和阿魏酸对于BMSCs的积极的诱导作用，本技术的研究核心点在于如何进一步提高诱导表现效果。发明内容本发明的目的在于提供一种BMSCs成骨化的诱导组合物、培养基和诱导方法，该组合物可以显著的提高诱导效果，相比于单一的阿魏酸、BMP2，其诱导效果更好。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种BMSCs成骨化的诱导组合物，所述的组合物的有效成分由BMP2和阿魏酸组成，所述的组合物中BMP2的浓度为1×10-4mgL；所述的阿魏酸的浓度为6.4×10-4molL。同时，本发明还提供一种BMSCs成骨化的诱导培养基，所述的培养基为的L-DMEM培养基，含有6.4×10-4molL阿魏酸，1×10-4mgLBMP2；所述的L-DMEM培养基含10wt％的FBS。同时，本发明还提供一种BMSCs成骨化的诱导方法，取正在培养的第三代骨髓间充质干细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化；所述的胰蛋白酶含有0.02wt％EDTA，加入如权利要求2所述的培养基制成单细胞悬液，以1×105孔的细胞密度接种在放入24孔板，培养24h即可。所述的0.25％的胰蛋白酶是指含0.25wt％胰蛋白酶的消化液。本发明的有益效果是：单独的阿魏酸或BMP2的Wnt3蛋白表达水平均明显低于BMP2和阿魏酸联合作用的表达水平。单独的阿魏酸组或BMP2组的β-catenin蛋白表达水平均明显低于BMP2和阿魏酸联合作用的表达水平。单独的阿魏酸组或BMP2组的Runx2蛋白表达水平均明显低于BMP2和阿魏酸联合作用的表达水平。上述三项结论的得出均经过试验证实，试验数据的差异具有统计学意义。附图说明图1为GAPDH参照品蛋白表达灰度图；图2为Wnt3蛋白表达灰度图；图3为β-catenin蛋白表达灰度图；图4为Runx2蛋白表达灰度图。具体实施方式下面结合具体实施方式说明本发明：但是可以理解这些具体的实施方式只是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。本领域的技术人员完全可以在本发明的启示下，对本发明的的具体实施方式或者技术特征进行改进，但这些经过改进或替换的技术方案，仍属于本发明的保护范围。实施例一本实施例分为几个板块对本发明的核心思路进行介绍，分别为：第一部分：试剂和仪器的介绍；第二部分：试验方法的介绍；第三部分：试验结果分析；第四部分：结论。下面逐一描述。第一部分：1.1试剂Aprotinin：上海浩然生物；Pepstatin：MedchemExpress；RIPA裂解液：AMQUAR；BCA蛋白定量试剂盒：SIGMA-ALDRICH；PMSF：汇百特生物科技；30％Acrylamide丙烯酰胺：上海微蒙生物科技；预染蛋白Ladder：北京萌壮科技有限公司；考马斯亮蓝R-250：华中海威北京基因科技有限公司；Tris：Amresco；Glycinl于氨酸：上海安研生物抗体试剂盒销售网；2×5×SDS十二烷基硫酸钠上样缓冲液：北京索莱宝科技有限公司；10×丽春红染液：GenView分装；betaAetin：北京中杉金桥；柯达XBT-1医用X射线胶片：北京诺博莱德科技有限公司；兔抗大鼠β-catenin：CellSignalingTechnology；兔抗大鼠Wnt3：CellSignalingTechnology；兔抗大鼠GSK3抗体：CellSignalingTechnology；通用显影粉：上海君瑞生物科技；定影液：上海君瑞生物科技；P38MAPKAntibody：CellSignalingTechnology；溴酚蓝：南京建成生物科技有限；冰乙酸：南京建成生物科技有限；甘油：南京建成生物科技有限；甲醇：南京建成生物科技有限；一抗稀释液：上海歌凡生物；二抗稀释液：上海歌凡生物；封闭液：上海歌凡生物；PVDF转印膜：上海泓岳膜技术有限公司；Immobilon-P转移膜：爱必信上海；ECL发光试剂盒：爱必信上海。1.2仪器高压锅：上海京工实业有限公司；玻璃匀浆器：上海博通化学科技有限公司；酶标仪：普朗医疗；—80℃低温冰箱：海尔集团电器有限公司；恒温水浴摇床:三江电子科技；TDK-2水平摇床:上海京工实业有限公司；迷你双垂直电泳槽DYCZ.24DN型：上海京工实业有限公司；电泳仪DG.300C：上海京工实业有限公司；电子分析天平：北京天星科仪；pH计：美控中国；微量加样器：Eppendort；多用脱色摇床：常州华冠仪器；台式高速冷冻离心机：北京时代北利离心机有限公司。1.3试剂储备液母液11.0molLTris·HCl：分别准确称取Tris：MW121.1460.58g四份，蒸馏水400ml，搅拌完全溶解，用浓HCl调pH，调至所PH值见下所示，蒸馏水定容至500ml，密封灭菌后，室温保存。210mmolLPMSF：准确称取PMSF0.174g，用适量异丙醇溶解，再用异丙醇定容至100ml，分装于1.5ml离心管，－20℃冰箱保存。30.2molLNaH2PO4：准确称取NaH2PO4MW119.9812.00g，用适量蒸馏水溶解，用蒸馏水定容至500ml，密封灭菌，室温保存。40.2molLNa2HPO4：准确称取Na2HPO4·12H2OMW358.1471.60g，用蒸馏水适量充分溶解，再用蒸馏水定容至1000ml，密封灭菌，室温保存。510％SDS：准确称取SDS10.00g，加蒸馏水至在50℃水浴中完全溶解，用蒸馏水定容至100ml，室温保存。使用时出现沉淀，水浴加热溶化后使用。610％过硫酸胺AP：准确称取过硫酸胺0.10g，用蒸馏水适量充分溶解，用蒸馏水定容至1.0ml，4℃保存，保存时间不超过1周。730％AcrBic29：1：分别准确称取丙稀酰胺29.00g和甲叉双丙稀酰胺1.00g，用蒸馏水适量37℃下充分溶解，用蒸馏水定容至100ml，4℃保存。使用时恢复至室温。820％Tween20：准确量取Tween2020.00ml，用蒸馏水适量溶解，用蒸馏水定容至100ml，4℃保存。1.4试剂配制1单去污剂裂解液50mmolLTris·HClpH8.0，150mmolLNaCl，1％TritonX－100，100μgmlPMSF准确量取1molLTris·HClpH8.02.5ml，TritonX－1000.5ml和准确称取NaCl0.438g，加适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶至50ml，4℃保存。用时，每0.87ml裂解液加入1.74mgmlPMSF50μl。2R-250考马斯亮蓝溶液准确称取考马斯亮蓝G250100mg，准确量取95％乙醇50ml和磷酸100ml，用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，加入磷酸和适量蒸馏水水，用蒸水至1000ml，配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和蒸馏水水，混合均匀，过滤，4℃保存。30.15molLNaCl准确称取NaCl0.877g，加适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶至100ml，灭菌，室温保存。410％分离胶：准确量取30％AcrBic29：10.5ml，1.5molLTris·HClpH8.80.5ml，10％SDS100μl，10％AP50μl，TEMED5μl，蒸馏水4.85ml，快速混合均匀后灌胶。54％浓缩胶：准确量取30％AcrBic29：10.5ml，0.5molLTris·HClpH6.82.5ml，10％SDS50μl，10％AP25μl，TEMED5μl，蒸馏水3.16ml，混合均匀后灌胶。6还原型5XSDS上样缓冲液准确量取0.5molLTris·HClpH6.82.5ml，甘油2.5ml，准确称取二硫叔糖醇DTT，MW154.50.39g，SDS0.5g，溴酚蓝0.025g，混合均匀，加适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶。7电泳液缓冲液准确称取TrisMW121.143.03g，甘氨酸MW75.0718.77g和SDS1g，加适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶1000ml，室温保存。8转移缓冲液48mmolLTris，39mmolL甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇加适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶。准确称取甘氨酸MW75.072.9g，TrisMW121.145.8g，SDS0.37g，准确量取甲醇200ml，适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶，室温保存。9丽春红染液准确称取丽春红S2.00g，三氯乙酸30.00g和磺基水杨酸30.00g，用适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶至100ml，使用时将其稀释10倍。10TBS缓冲液100mmolLTris·HClpH7.5，150mmolLNaCl准确量取1molLTris·HClpH7.510ml，准确称取NaCl8.8g，用适量蒸馏水溶解，加蒸馏水定溶至1000ml。11TBST缓冲液含0.05％Tween20的TBS缓冲液准确量取20％Tween201.65ml和TBS700ml，混合均匀，即可使用，现配现用。12显影液准确称取米吐尔1.55g，亚硫酸钠无水22.50g，碳酸钠无水33.75g和溴化钾20.95g，量取自来水水浴加热至50℃375ml，用自来水定溶至500ml，配制时，上述试剂应逐一加入到溶解。4℃保存。使用时用自来水稀释至5倍。13定影液准确称取硫代硫酸钠240g，亚硫酸钠无水15g，冰乙酸12.6ml，硼酸7.5g和钾明矾15g，量取自来水700ml，加自来水定容至1000ml，室温保存。第二部分2.1骨髓间充质干细胞的诱导培养2.1.1实验分组本实验随机分4组，每组设为3复孔，各组使用对应的培养基：1空白对照组培养基：单纯10％FBSL-DMEM培养基100mL；2BMP2组培养基：10％FBSL-DMEM培养基100mL+0.1ml100ngmlBMP2培养基；3阿魏酸组培养基：6.4×10-4molL阿魏酸的10％FBSL-DMEM培养基100mL；4BMP2+阿魏酸处理组培养基：6.4×10-4molL阿魏酸的10％FBSL-DMEM培养基100mL+0.1ml100ngmlBMP2培养基；2.1.2细胞准备取正在培养的第三代骨髓间充质干细胞，用0.25％的胰蛋白酶含0.02％EDTA消化，加入10％FBSL-DMEM培养基制成单细胞悬液，以1×105孔的细胞密度接种在放入24孔板，培养24h。2.1.3培养干预取细胞，弃上清液，分别加入对应的干预培养基进行培养，每2天更换培养液一次，共培养6天。2.1.4四组各总蛋白的提取BMSC按分组培养6天后，各组进行总蛋白提取。1.裂解液的配制：取适当量RIPA裂解液，于使用前数分钟和PMSF按100：1比例混合均匀，使PMSF的最终浓度为lmM，冰上保存待用。2.干预结束后的细胞，吸弃上清液，用提前用冰上预冷后的PBS洗3遍，将瓶倒扣在吸水纸上吸干PBS后，置冰上放置。3.按1ml裂解液加10μlPMSF100mM，摇匀置于冰上。4.每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解0.5h，经常来回摇动解培养瓶要。5.充分裂解后，将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中，以12000rpm，4℃离心5min。6.吸取上清液，放置于-80℃冰箱保存备用。2.1.5WB蛋白检测westernblot2.1.5.1四组细胞总蛋白的变性按每4ul蛋白样品加lulSDS.PAGE蛋白上样缓冲液：5×的比例涡旋混匀，100℃金属浴5min，充分变性蛋白后，置冰上迅速冷却，存于-80℃冰箱备用或进行下一步操作。2.1.5.2SDS-PAGE蛋白质电泳1玻璃板：清洁干净后，用蒸馏水冲洗后立在筐里晾干。2灌胶与上样：装好玻璃板，晾干，垂直卡在架子上灌胶。按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀后灌胶。当水和胶之间有一条折射线时，3min使胶充分凝固，倒去胶上层水，用吸水纸吸干。按前面方法配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀后灌胶，快速插入梳子，小心产生气泡，常温下，待凝胶聚合。用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。3蛋白电泳待凝胶完全凝固后，装好电泳装置，加入l×电泳缓冲液，小心拔出梳子。根据样品的浓度，按每孔20ug的加样量计算出样品所需上样体积，依次上样。电泳时间4～5h，电压为40V或60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。2.1.5.3湿式转膜1.转膜前准备：根据预染mark所示目的蛋白相对位置切取目的蛋白所在胶条，凝浸于转移缓冲液中。准备好与胶大小相近的滤纸6张和PVDF膜1张，将PVDF膜泡于无水甲醇活化10min后，同已裁剪好的滤纸和海绵垫一起浸于转移缓冲液中。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。2.制作转移“三明治”：按照下表所示顺序放置：负极电转夹板海绵垫1张滤纸3张凝胶PVDF膜滤纸3张海绵垫1张正极电转夹板。注意对齐，避免滤纸、胶、PVDF膜之间产生气泡，扣好电转夹板，放入加满转膜缓冲液的电泳槽中，同时电泳槽置于盛有碎冰的泡沫盒中。3.转膜：将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面，放入电泳槽中，一般用60V转移2h或40V转移3h，电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温，转膜结束后，立即用考马斯亮蓝染液染胶35min，结束后把胶置洗脱液中，在摇床上洗至透明，检查蛋白转移是否完全。2.1.5.4免疫反应1.封闭：用TBST从下向上浸润洗PVDF膜3min×2次，将PVDF膜放入含有封闭液的100mm培养皿，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。2.一抗孵育：根据说明书在1.5ml离心管中将一抗用TBST稀释至适当浓度，适当大小保鲜膜铺于实验台面上，将抗体溶液加到保鲜膜上，将PVDF膜置于一抗工作液中，掀动膜四角以赶出残留气泡，室温下孵育1～2h后再用TBST室温下水平摇床上洗涤膜3次，每次10min，洗去除未结合的一抗。3.二抗孵育：同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后再用TBST室温下水平摇床上洗涤膜3次，每次10min，洗去除未结合的二抗，准备进行下一步化学发光反应。2.1.6ECL化学发光检测根据需要量，配带BeyoECLPlus工作液，等体积混合，1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，1min后将膜覆于干净的保鲜膜上：正面朝上，吸干多余液体，滴加适量的发光液覆盖膜面，放入X-光片夹中。在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中，打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；适当调整曝光时间，控制在1-5min，曝光完成后打开X-光片夹，取出X-光片浸入显影液中显影，显影时间一般为1-2min，在常温下进行，待出现明显条带后，立即终止显影。显影结束后即刻把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5至10分钟，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。2.1.7扫描及分析将胶片进行扫描或拍照，扫描胶片用QuantityOne图像分析软件分析目标条带分子量。第三部分参考图1，图1为GAPDH参照品蛋白表达灰度图；图2为Wnt3蛋白表达灰度图，从左至右依次为空白对照组、阿魏酸干预组、BMP2干预组和阿魏酸+BMP2干预组；图3为β-catenin蛋白表达灰度图，从左至右依次为空白对照组、阿魏酸干预组、BMP2干预组和阿魏酸+BMP2干预组；图4为Runx2蛋白表达灰度图，从左至右依次为空白对照组、阿魏酸干预组、BMP2干预组和阿魏酸+BMP2干预组；表1为Wnt3蛋白条带灰度比值数据表1Wnt3蛋白条带灰度比值数据注：P0.5表2为β-catenin蛋白条带灰度比值数据表2β-catenin蛋白条带灰度比值数据注：P0.5表3为Runx2蛋白条带灰度比值数据表3Runx2蛋白条灰度值带数据注：P0.5第三部分通过图1-4以及表1-3可以清晰的得到以下结论：Wnt3蛋白：与正常对照组相比较，阿魏酸组、BMP2组和BMP2+阿魏酸组的Wnt3蛋白的表达水平均明显比正常对照组高，差异具有显著的统计学意义；与BMP2+阿魏酸组相比，单独的阿魏酸组或BMP2组的Wnt3蛋白表达水平均明显低于BMP2+阿魏酸组，差异具有统计学意义；阿魏酸组与BMP2组之间Wnt3蛋白的表达水平之间的差异没有统计学差异。见表1β-catenin蛋白：与正常对照组相比较，阿魏酸组、BMP2组和BMP2+阿魏酸组的β-catenin蛋白的表达水平均明显比正常对照组高，差异具有显著的统计学意义；与BMP2+阿魏酸组相比，单独的阿魏酸组或BMP2组的β-catenin蛋白表达水平均明显低于BMP2+阿魏酸组，差异具有统计学意义；阿魏酸组与BMP2组之间β-catenin蛋白的表达水平之间的差异没有统计学差异。见表2Runx2蛋白：与正常对照组相比较，阿魏酸组、BMP2组和BMP2+阿魏酸组的Runx2蛋白的表达水平均明显比正常对照组高，差异具有显著的统计学意义；与BMP2+阿魏酸组相比，单独的阿魏酸组或BMP2组的Runx2蛋白表达水平均明显低于BMP2+阿魏酸组，差异具有统计学意义；阿魏酸组比BMP2组Runx2蛋白表达水平稍低，但没有统计学差异。见表3。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种BMSCs成骨化的诱导组合物，其特征在于，所述的组合物的有效成分由BMP2和阿魏酸组成，所述的组合物中BMP2的浓度为1×10-4mgL；所述的阿魏酸的浓度为6.4×10-4molL。2.一种BMSCs成骨化的诱导培养基，其特征在于，所述的培养基为含有6.4×10-4molL阿魏酸和1×10-4mgLBMP2的L-DMEM培养基；所述的L-DMEM培养基含10wt％的FBS。3.一种BMSCs成骨化的诱导方法，其特征在于，取正在培养的第三代骨髓间充质干细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化；所述的胰蛋白酶含有0.02wt％EDTA，加入如权利要求2所述的培养基制成单细胞悬液，以1×105孔的细胞密度接种在放入24孔板，培养24h即可。

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