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申请/专利权人：通用生物(安徽)股份有限公司

摘要：本发明公开了一种基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，首先将CRISPRCas9质粒pRedCas9‑N20转入目的菌株，再将体外扩增的带有PAM以及抗性marker序列的donor片段导入大肠杆菌，配合CRISPRCas9质粒基于Red同源重组将带有PAM序列的donor整合入基因组，再通过配合CRISPRCas9对PAM序列进行切割，再进行同源重组DSB修复，将标记maker消除，以及基因组无痕编辑，如果还需继续编辑，只需重新设计线性片段，无需再设计PAM序列，同样用于编辑使用的质粒可大量准备，用于多个菌株编辑，且本发明编辑效率高，单基因编辑时间短，编辑出的PAM序列固定。

主权项：1.基于CRISPRCas9连续基因编辑方法，其特征在于：具体包括如下步骤：步骤S1：将构建好的质粒pRedCas9-N20转化进入目的菌株中，在LB、Kan、质量浓度1％的葡萄糖混合板，温度为30-35℃的条件下，进行培养；步骤S2：取步骤S1培养的单克隆，在LB单管中，温度为30-35℃的条件下，进行过夜培养；步骤S3：从步骤S2的单管中取出1mL种子液加入到150mL500mLLB培养基锥形瓶中，添加阿拉伯糖诱导剂和相应Kan抗性，进行培养后，测OD600值；步骤S4：取出三角瓶，迅速将培养菌液的三角瓶放入事先准备好的冰盒中，冰浴30min，并摇动三角瓶；步骤S5：将冷却后的菌液加入预冷过的50mLEP管中，将50mLEP管放在天平上配平后，放入冷冻离心机上，进行离心后，从离心机中取出50mLEP管，放入冰盒中，在超净台上取出，弃掉上清中的残余培养基；步骤S6：待残液弃净后，在超净台中打开50mLEP管的盖子，使用DDH2O悬浮沉淀，盖上50mLEP管的盖子，放入离心机离心，进行离心，再使用10％甘油重复洗两次，清洗完毕后，打开50mLEP管的盖子，弃去上清，再进行倒置，以保证残液完全弃完；步骤S7：按照每份100μL液体在超净台中向50mLEP管中加入10％甘油，摇动50mLEP管，将沉淀的菌体悬浮，然后事先准备干净的1.5mL已经灭菌处理的预冷EP管，按照每份100μL分装后写上相应感受态的标记以及制作感受态的时间后，丢入液氮中速冻后，在温度为-80℃的条件下，进行保藏备用；步骤S8：将带有抗性标记和PAM的donor片段，加到感受态细胞内，置于冰上备用，制得感受态混合液；步骤S9：打开电转仪，将电转细菌调至Ec2，将100μL感受态混合液加入电转杯中，进行电击后，向电击杯中加入SOC培养基500μL，混匀后，全部吸到1.5mL的EP管中插入冰上备用；步骤S10：将步骤S9得到EP管放入摇床中，进行孵育后，进行离心并涂Kan+cm抗性平板进行培养后，编辑位点PCR菌检验证基因组是否得到成功编辑；步骤S11：将步骤S10得到成功克隆转移到含Kan的LB中，进行摇菌2h后，加入IPTG和L-阿拉伯糖诱导CRISPRCas9系统的表达，培养6h后，涂布在LB、Kan、L-arabinose琼脂、IPTG混合平板上，在温度为30-35℃的条件下，进行培养；步骤S12：将步骤S11培养的菌落进行PCR，验证作为标记的marker的cm抗性基因是否移除成功，并涂布在cm抗性平板再次验证cm抗性是否得到去除；步骤S13：若还需继续编辑，从步骤S2开始至重复步骤S12，进行连续编辑，若无需继续编辑，进行步骤S14；步骤S14：敲除成功编辑的菌株，在含Kan的LB平板上划线接种，在温度为42℃的条件下，进行孵育24h后，挑取单菌落依次接种在Kan和Cm对应部位；步骤S15：将作为标记抗性加pRedCas9-N20质粒去除的正确编辑的菌株，进行保存，完成基因编辑；步骤S11所述的IPTG的加入量为0.1mM，L-阿拉伯糖的加入量为2gL。

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