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申请/专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所

摘要：本发明公开了一种基于LAMP‑CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，包括以下操作步骤：1组织样品的处理；2病毒DNA的提取；3引物设计；4PCR产物回收及纯化；5标准质粒的构建；6重组质粒鉴定；7质粒DNA小量抽提；8LAMP引物筛选及扩增；9猪圆环病毒2型LAMP‑CRISPR‑Cas12a检测体系建立；本发明在CRISPR技术的基础上与LAMP技术相结合，建立了PCV2的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要复杂仪器设备。这种低价、高度敏感和特异性强、便携式和可视化的方法将是现场PCV2检测的替代方法，这可能有助于及时监测和快速制定控制PCV2的策略。

主权项：1.一种基于LAMP-CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：步骤1：组织样品的处理，将称取约1g的各组织样品，加入1mLPBS后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpmmin离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；步骤2：病毒DNA的提取；步骤3：引物设计，在GenBank中检索多株猪圆环病毒2型全基因组序列，通过Meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段ORF2基因，使用PrimerPremier5软件，设计ORF2基因的全长引物；以高度保守片段ORF2基因，运用在线生物网站PrimerExplorerV5https:primerexplorer.jp设计4条计特异性的LAMP扩增引物；猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段ORF2基因，使用CRISPR-DT引物设计网站设计猪圆环病毒2型ORF2基因的crRNA引物和探针，并委托某生物有限公司合成；步骤4：PCR产物回收及纯化，根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用，置于-20℃保存；步骤5：标准质粒的构建，根据某公司的pMDTM19TVectorCloningKit使用说明书，构pMDTM18T-ORF2重组质粒；步骤6：重组质粒鉴定，取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在NCBI网站的BLAST功能和Meglign软件与Cap基因全长进行比对分析；步骤7：质粒DNA小量抽提，根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pMDTM18-ORF2重组质粒备用；步骤8：LAMP引物筛选，根据LAMP核酸扩增试剂盒说明扩增猪圆环2型，筛选出最佳LAMP引物；步骤9：猪圆环病毒2型LAMP-CRISPRCas12a检测体系建立；最佳浓度筛选：设置LbCas12a蛋白浓度分别为25nM、50nM、100nM、150nM、200nM，设置crRNA浓度设置分别为25nM、50nM、100nM、150nM、200nM进行正交试验，筛选出最佳的反应浓度比crRNA筛选：对设计的五对猪圆环病毒2型crRNA引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育50min，在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；灵敏度试验；特异性试验；重复性检验：选择105～103copiesμL的稀释质粒，利用已确定的最佳检测体系进行3次重复，并于不同时间点再重复检测，以确定该方法的重复性；临床样本检测：根据DNA提取方法进行对临床样本进行DNA的提取，与LAMP基础型核酸扩增试剂相结合，使用PrimerPremier5软件，设计Cap基因的ERA引物，采用本研究建立的CRISPRCas12a方法对15份样本进行PCV4的检测，同时，使用qPCR技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价CRISPR技术的临床应用的实用价值。

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