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龙图腾网恭喜浙江大学申请的专利一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制、实验方法及应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN113604542B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-02-18发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202110684479.5，技术领域涉及：C12Q1/6851；该发明授权一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制、实验方法及应用是由沈承勇;陈爱中;张克兢设计研发完成，并于2021-06-21向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制、实验方法及应用在说明书摘要公布了：本发明公开了一种Agrin‑MuSK‑DOK7信号通路的负调控机制、实验方法及应用，Agrin刺激肌管激活MuSK后，MuSK促进DOK7Tyr106发生磷酸化，在CDH1的帮助下，APC2与Tyr106磷酸化的DOK7结合并介导DOK7Lys243发生以K48连接方式为主的泛素化，促进DOK7通过蛋白酶体系统降解，最终导致DOK7蛋白水平下调，实现对Agrin‑MuSK‑DOK7信号通路的负调控。本发明中APC2CDH1通过促进DOK7泛素化与降解从而实现对Agrin‑MuSK‑DOK7信号通路的负调控，避免Agrin‑MuSK‑DOK7信号通路的过度激活导致NMJ发育异常。本发明为深入了解神经肌肉接头发育的分子机制提供新的理论依据，也为开发相关疾病的治疗方法提供新的思路。

本发明授权一种Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制、实验方法及应用在权利要求书中公布了：1.一种研究Agrin-MuSK-DOK7信号通路的负调控机制的实验方法，其特征是，包括：1在体外模拟体内的Agrin-MuSK-DOK7信号通路激活过程，用Agrin刺激C2C12分化的肌管，在不同的刺激时间点收集样品进行LRP4，MuSK、p-MuSK、DOK7蛋白水平的Westernblot检测；2采用Q-PCR检测Agrin刺激前后的LRP4，MuSK和DOK7的mRNA水平；3在Agrin刺激肌管前，预先用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬-溶酶体抑制剂CQ处理肌管1h，然后再用Agrin刺激肌管后收样进行DOK7蛋白水平的Westernblot检测；（4）通过转染泛素野生型质粒、只保留第48位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒和只保留第63位赖氨酸而其余六个赖氨酸均突变为精氨酸的泛素突变体质粒来检测DOK7泛素化的泛素连接方式，在HEK293T细胞转染相应的质粒，转染24h用Flag抗体进行IP检测，再用HA抗体对IP产物中DOK7的泛素化水平进行检测；5对DOK7中的第243位赖氨酸进行点突变构建DOK7-K243R突变体，在HEK293T细胞转染相应的质粒，转染24h后收样，用Flag抗体进行IP检测，再用HA抗体对IP产物中DOK7的泛素化水平进行检测；（6）把DOK7氨基酸序列中第106位酪氨酸突变为丙氨酸，在HEK293T细胞转染相应的质粒，转染24h后收样，用Flag抗体进行IP检测，再用HA抗体对IP产物中DOK7的泛素化水平进行检测；（7）对DOK7Tyr106磷酸化是否调控APC2CDH1对DOK7的底物识别进行检测：DOK7氨基酸序列中第106位酪氨酸突变为丙氨酸，在HEK293T细胞转染相应的质粒，转染24h后收样，用GFP抗体对GFP-DOK7进行co-IP检测，再用Flag抗体检测co-IP产物中与DOK7结合的APC2蛋白水平；（8）对Agrin是否调控肌管内源性DOK7与APC2的结合进行检测：用DOK7的抗体进行co-IP检测，再用APC2抗体检测co-IP产物中与DOK7结合的APC2蛋白水平；其中，构建DOK7点突变质粒时，PCR反应体系如下：ddH2O7.5μl；F引物1μl；R引物1μl；2×PrimeStarmaxmix10μl；模板质粒0.5μl；引物序列分别为：DOK7-Y106A-F:GGATGCCCGGATCCGCGCTGCGCTCGGCGAGGTG；DOK7-Y106A-R:CACCTCGCCCAGCGCAGCGCGGATCCGGGCATCC；DOK7-K243R-F；CCCTACAGCTGGAGAGGCGGCTGAGCCTCCTCTCA；DOK7-K243R-R：TGAGAGGAGGCTCAGCCGCCTCTCCAGCTGTAGGG。

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