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摘要：本发明公开了一种肺炎克雷伯菌铁载体蛋白fecA3的纯化方法，包括如下步骤，（1）fecA3重组载体转化；（2）fecA3蛋白诱导表达与检测；（3）取诱导后菌液1mL，离心收集菌体，与未诱导对照一同进行SDS‑PAGE分析，检测fecA3蛋白的表达；（4）Ni柱亲和层析纯化；（5）蛋白复性与浓缩；（6）纯化与复性后fecA3蛋白的鉴定；（7）质谱鉴定：利用LC‑MSMS质谱技术对纯化的fecA3蛋白进行了鉴定。本发明解决了纯度差及产量低的问题，本发明通过截断一段肺炎克雷伯菌种属fecA3蛋白特有的信号肽的方案，大大降低fecA3蛋白的疏水性，成功的对肺炎克雷伯菌的fecA3蛋白进行纯化，并且质谱鉴定成功表达，且纯度达到99.7%，且分子量与预期相符。

主权项：1.一种肺炎克雷伯菌铁载体蛋白fecA3的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、fecA3重组载体转化：将构建成功的pet-28a-fecA3-去除信号肽的质粒加入大肠杆菌BL21-DE3感受态细胞中，冰浴20分钟后，42℃热激90秒，再冰浴5分钟,加入600μLLB培养基，37℃振荡培养1小时，离心后涂布于含50μgmL卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜;S2、fecA3蛋白诱导表达与检测：挑取转化平板上的单克隆菌落，接种于4mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；次日按1:100比例扩大培养至100mL，待菌体生长至对数期时，取1mL作为未诱导对照，剩余菌液加入IPTG至终浓度0.2mM，30℃220rmin振摇10h，诱导fecA3蛋白表达；S3、取诱导后菌液1mL，离心收集菌体，与未诱导对照一同进行SDS-PAGE分析，检测fecA3蛋白的表达；S4、Ni柱亲和层析纯化：将诱导表达的菌液离心收集菌体，超声波破碎后取上清液进行Ni柱亲和层析纯化；依次用含有不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，收集流出液并进行SDS-PAGE分析，监测目的蛋白的洗脱情况；S5、蛋白复性与浓缩：将纯化的fecA3蛋白溶液进行透析复性，逐渐降低透析液中的尿素浓度，使蛋白逐渐折叠复性，复性后采用PEG20000进行浓缩处理，提高蛋白浓度；S6、纯化与复性后fecA3蛋白的鉴定：对经过Ni柱亲和层析纯化、复性与浓缩处理后的fecA3蛋白进行SDS-PAGE分析，通过考马斯亮蓝染色观察蛋白条带，评估纯化效果以及fecA3蛋白的完整性和纯度。

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