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申请/专利权人：瑞吉明(山东)生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种DNA钙盐和抗菌肽联合制备的方法，属于多肽制备技术领域，解决了现有方法钠盐置换DNA钙盐，置换效率无法保证，且在钠离子对钙离子置换后DNA钠盐的稳定性、抗菌活性和生物相容性较差的问题，方法包括：通过提取酶提取动物组织废液中的DNA分子；预制备纳米钙混合物，将预制备的纳米钙混合物与第二过滤液混合搅拌，保留上清液，得到DNA钙盐。本发明通过预制备纳米钙混合物，并将预制备的纳米钙混合物与第二过滤液混合搅拌，从而得到稳定性、抗菌活性和生物相容性高的DNA钙盐，制备的DNA钙盐通过与抗菌肽的结合，可以发挥协同抗菌作用，提高抗菌效果。

主权项：1.一种DNA钙盐和抗菌肽联合制备的方法，其特征在于，包括：取提取肝素后的动物组织废液，向动物组织废液加入提取酶，通过提取酶对动物组织废液中的DNA分子进行提取，得到初提取液；取初提取液，加热至75℃后搅拌处理，并保持加热时间20min，实现酶灭活处理，采用布氏漏斗对初提取液进行抽滤处理，得到第一过滤液，并采用1:1体积比的苹果酸和氯化钠溶液对抽滤沉淀物洗脱，将洗脱液与第一过滤液混合；向洗脱液与第一过滤液的混合液中加入等体积的0.03mmolL乙醇溶液，并使用0.45μm的滤膜过滤，得到去除蛋白水解物的第二过滤液；预制备纳米钙混合物，将预制备的纳米钙混合物与第二过滤液混合搅拌，搅拌速度控制为40-60rmin，搅拌时间为1h，并采用苹果酸调节pH值为5.5-6.5，静置36h后，保留上清液，得到DNA钙盐；预制备多肽混合物，并向多肽混合物中加入缓冲剂、表面活性剂，得到抗菌肽组合物，将抗菌肽组合物、DNA钙盐混合，得到纳米级抗菌肽；所述纳米级抗菌肽由以下重量份的原料组成：DNA钙盐50-100份、抗菌肽组合物100-150份、缓冲剂200-250份、表面活性剂10-20份、聚多巴胺1-10份、单宁酸1-5份；所述提取酶包括以下重量百分比的原料：木瓜蛋白酶：20％；二亚乙基三胺五乙酸：13％；菠萝蛋白酶：12％；胰蛋白酶：20％；钙蛋白酶：15％；海藻酸钠：15％；氯化钠：4％；纳米蒙脱石：1％；所述提取酶的制备方法，具体包括：取去离子水，将海藻酸钠溶于去离子水中，得到海藻酸钠溶液，采用30％盐酸调节海藻酸钠溶液pH至6.5，向海藻酸钠溶液中加入胰蛋白酶、钙蛋白酶和菠萝蛋白酶，得到酶第一混合物；获取酶第一混合物，在65℃环境下水浴搅拌1.5h，将浓度为0.3molL的氯化钠水溶液滴加至酶第一混合物内，得到酶第二混合物；取木瓜蛋白酶、二亚乙基三胺五乙酸水溶液混合，超声30min后，静置50min，得到酶第三混合物；以钙基蒙脱石为纳米蒙脱石的制备基材，采用3molL的硫酸溶液在聚四氟乙烯瓶中对钙基蒙脱石进行酸活化处理，在室温环境下，每间隔4h摇晃一次聚四氟乙烯瓶，反应48h后将溶液离心分离，以50％的乙醇水洗3-6次，然后将酸活化后的钙基蒙脱石真空干燥24h，研磨处理后将钙基蒙脱石与等重量的十六烷基三甲基溴化铵、烷基氨基酸混合，得到纳米蒙脱石；将酶第二混合物、酶第三混合物、纳米蒙脱石混合，在65℃水浴环境下搅拌2h，混合完毕后，静置1h，得到提取酶；所述纳米钙混合物包括以下重量百分比的原料：氯化钙：20％；纳米壳聚糖：10％；纳米二氧化钛：40％；L-天冬氨酸纳米钙：30％；所述预制备纳米钙混合物的方法，具体包括：取牡蛎壳为L-天冬氨酸纳米钙制备原料，清洗牡蛎壳表面杂质和泥沙，清洗完毕后采用生理盐水冲洗后吸干水分，将牡蛎壳在35％氢氧化钠水溶液中固定12h，采用无水乙醇冲洗，对牡蛎壳进行切片处理，采用高速破碎机粉碎50min，再用超声粉碎仪粉碎20min，向粉状牡蛎壳粉中加入亮抑蛋白酶肽、L-天冬氨酸以及去离子水，得到L-天冬氨酸纳米钙混合液，并调节L-天冬氨酸纳米钙混合液pH值为5.5-6.5，得到L-天冬氨酸纳米钙；取壳聚糖，将壳聚糖溶于体积分数为3％的冰醋酸内，以200-250rmin的搅拌速度搅拌2h，然后采用苹果酸调节pH为5-5.5，采用中空纤维膜组件对壳聚糖进行过滤，得到壳聚糖过滤液；配制浓度为0.8mgmL的六偏磷酸钠水溶液，将壳聚糖过滤液、六偏磷酸钠水溶液置于80℃水浴锅中搅拌20min，搅拌速度控制为200-220rmin，得到纳米壳聚糖悬浮液；将纳米二氧化钛颗粒投入纳米壳聚糖悬浮液中，然后向纳米壳聚糖悬浮液中加入0.02倍体积的甘油以及0.5倍体积的冰醋酸，对纳米壳聚糖悬浮液超声均匀搅拌30min，然后分别将L-天冬氨酸纳米钙、氯化钙与纳米壳聚糖悬浮液混合，在120℃下干燥处理48h，得到纳米钙混合物；所述抗菌肽组合物的制备方法，具体包括：取金环蛇毒抗菌肽、LL-37抗菌肽、乳清蛋白肽混合，将金环蛇毒抗菌肽、LL-37抗菌肽、乳清蛋白肽溶于磷酸氢二钠溶液中，室温混合搅拌30min，采用苯酚洗涤1-3次，得到多肽混合物，其中，金环蛇毒抗菌肽、LL-37抗菌肽、乳清蛋白肽的重量比为1:3:2；预制备缓冲剂，将含有金环蛇毒抗菌肽、LL-37抗菌肽、乳清蛋白肽的多肽混合物溶于缓冲剂中，得到多肽混合溶液，振荡混合50min，控制反应温度为30-45℃；在氮气保护环境下将表面活性剂与多肽混合溶液混合，然后调节多肽混合溶液pH为6.5-7.2，向多肽混合溶液中滴加聚乙二醇和甘露醇进行加成稳定反应24h，透析冻干处理，得到抗菌肽组合物；所述缓冲剂为十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、海藻酸钠、柠檬酸钠的混合物，且十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、海藻酸钠、柠檬酸钠的体积比为1:2:1:2；所述表面活性剂为十八烯酸钠、甜菜碱、月桂醇的混合物，且十八烯酸钠、甜菜碱、月桂醇的重量比为5:3:1。

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