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用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3的ELISA试剂盒及检测方法 

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申请/专利权人:中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院

摘要:本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的检测AFP‑L3的ELISA试剂盒及检测方法,该试剂盒包括AFP‑L3标准品、AFP单克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶SA‑HRP、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液、终止液。采用该试剂盒进行检测的方法为:在AFP单克隆抗体包被的酶标板中加待测样品,然后加生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素,随后加链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶;再加入显色液,最后加入终止液终止反应,并采用酶联检测仪测定吸光度值。本发明的试剂盒直接通过凝集素代替二抗对AFP‑L3进行检测,使AFP‑L3的检测更加简便、快捷。

主权项:1.一种用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒,其特征在于:所述的ELISA试剂盒包括:(A)AFP-L3标准品;(B)AFP单克隆抗体包被的酶标板;(C)生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液;所述AFP-L3标准品的制备方法为:称取1000µgAFP标准品,溶于1mL的浓度为0.01molL且pH为7.4的PBS缓冲液,吸取600µL加入到小扁豆凝集素亲和吸附离心管中,室温静置10min,吸取1.2mL清洗液加入离心管中,3000r室温下离心20s,弃去离心液体,加入600µL洗脱液到上部离心管,3000r室温下离心收集离心柱外管液体,即所需要的AFP-L3标准品;所述AFP单克隆抗体包被的酶标板的制备过程为:取1mgmL的AFP单克隆抗体用包被液以1:800的比例稀释后加入酶标板各孔,每孔100µL,4℃包被过夜;随后甩去酶标板孔内液体,采用洗涤液PBST浸泡3min,反复洗涤3次,拍干酶标板内液体后用封闭液,200µL孔,室温孵育30min,再次洗板3次,甩干后拍干,每孔加入100µLPH为4.5,浓度为20mmolL的醋酸钠,4℃孵育30min后甩干,随后加入新鲜配置的25mmolLNaIO4溶于PH为4.5的醋酸钠中,每孔100μL,4℃避光孵育1.5h后20mmolL醋酸钠洗涤3次,每次5min,拍干后加入1mmolLMPBH每孔100μL,18-22℃,避光孵育2h后加入1mmolLCys-Gly溶液每孔100μL,4℃避光孵育过夜;最后采用洗涤液PBST洗3次板,每次5分钟,甩干后晾干,即获得AFP-L3单克隆抗体包被的酶标板;所述稀释液为PBS缓冲液;所述PBS缓冲液的配制方法为:将0.2700ɡKH2PO4、1.4200ɡNa2HPO4、8.0000ɡNaCl、0.2000ɡKCl、加去离子水约800mL,充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调节PH至7.4,并定容至1000mL,高压灭菌,4℃保存;所述洗涤液为PBST缓冲液;所述PBST缓冲液的配制方法为:将8.0gNaCl、0.2gKCl、0.26gKH2PO4、2.9gNa2HPO4•12H2O、0.5mLTween-20、0.2gNaN3,加蒸馏水溶解后定容至1000mL,高压灭菌,4℃保存;所述封闭液为含1%BSA的PBST缓冲液,配置好的封闭液经过滤除菌后,4℃保存;所述TMB显色液为磷酸盐-枸橼酸缓冲液;所述终止液为将90mL蒸馏水,逐渐滴加入10mL98%浓硫酸中所配制而成的溶液。

全文数据:

权利要求:

百度查询: 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院 用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3的ELISA试剂盒及检测方法

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