买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：广州达安基因股份有限公司

摘要：本发明属于生物技术领域，其公开了一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒，该二代测序文库的构建方法包括步骤：对RNA核酸和DNA核酸进行一链合成，得到一链cDNA；对述一链cDNA进行二链合成，得到二链cDNA；对二链cDNA片段化、末端修复、磷酸化及加A处理后得到加A产物；将加A产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标RNA片段和DNA片段并回收；对目标RNA片段和DNA片段进行PCR扩增反应，以构建并得到所述RNA和DNA二代测序文库。该方法构建二代测序文库，采用整体建库流程，工艺步骤简化，极大缩减了操作流程和实验时间，可最大程度减少核酸样本的损耗，同时，无需构建两种文库，可大大节约人力、试剂、时间等成本。

主权项：1.一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、对RNA核酸和DNA核酸进行一链合成，得到一链cDNA；S2、对所述一链cDNA进行二链合成，得到二链cDNA；所述二链合成的具体步骤包括：将所述一链cDNA与反应物D、酶混合液E进行二链合成反应，得到所述二链cDNA；其中，反应液D包括Tris-HCl、MgCl2、KCl、DTT、NAD+、BSA、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶混合液E包括DNAPolymeraseI、E.coliDNALigase及RNaseH；其中，所述二链合成反应条件为：反应温度为16℃、反应时间为30-60min；S3、通过一步反应，实现对所述二链cDNA片段化、末端修复、磷酸化及加A处理后得到加A产物；所述一步反应包括如下步骤：将所述二链cDNA与反应液F和酶混合液G进行混合反应，得到所述加A产物；其中，所述反应液F包括Tris-HCl、MgCl2、NaCl、DTT、TritonX-100、ATP、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶混合液G为Vvnendonucleasemutan、T7endonucleasemutant和TaqDNApolymerase的混合液;其中，一步反应条件为：反应温度为37℃、反应时间为10-30min；接着，反应温度为65℃、反应时间为20-30min；S4、将所述加A产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标RNA片段和DNA片段并回收；S5、以回收的所述目标RNA片段和DNA片段作为模板进行PCR扩增反应，以富集所述目标RNA片段和DNA片段，构建并得到所述RNA和DNA二代测序文库；所述PCR扩增反应包括步骤：将所述目标RNA片段和DNA片段与反应液K和反应液L进行混合反应，得到RNA和DNA的二代测序文库；其中，所述反应液K包括5*Q5buffer、dATP、dGTP、dCTP、dTTP及Q5热启动超保真DNA聚合酶；所述反应液L为Illumina文库扩增引物或MGISEQ文库制备引物；步骤S1中，一链合成还包括如下步骤：S11、将RNA与RandomPrimers于65℃进行结合处理5min，得到RNA结合产物；S12、将所述RNA结合产物与反应液A、酶B和酶C进行混合反应，得到所述一链cDNA；其中，反应液A包括Tris-HCl、MgCl2、KCl、DTT、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶B为M-MMLV酶；所述酶C为Rnasin酶；其中，一链合成反应条件为：首先，反应温度为25℃、反应时间5-15min；接着，反应温度为42℃、反应时间为10-20min；然后，反应温度为70℃、反应时间为10-30min；步骤S4中，所述接头连接包括如下步骤：将所述加A产物与反应液H、反应液I和酶J进行混合反应，得到RNA片段和DNA片段；其中，所述反应液H包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP及PEG8000中；所述反应液I为接头X为Illumina接头或MGISEQ接头Ad153；所述酶J为T4DNAligase连接酶；接头反应条件为：反应温度为20℃、反应时间为30min；步骤S4中，所述第一次纯化处理包括如下步骤：S41、将所述RNA片段和DNA片段、80μL磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使RNA片段和DNA片段与磁珠充分混匀；S42、采用EP吸管反复吹打RNA片段和DNA片段，使其与磁珠充分混匀，将离心管置于磁力架上室温静置；S43、待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；S44、往离心管中加入200μL新鲜配制的80vv%乙醇漂洗磁珠；S45、重复步骤S42至S44；S46、将离心管离心处理后，再把离心管置于磁力架上，彻底去除离心管中的上清液；S47、将离心管中的样品取出来，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，得到所述目标RNA片段和DNA片段。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 广州达安基因股份有限公司 一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒