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申请/专利权人：上海百迈博制药有限公司

摘要：本发明公开了一种用于大规模生产的CHO细胞表达抗VEGF人源化单克隆抗体Fab片段的纯化方法，该方法能够有效降低培养物中酸性变异体含量，提高目标蛋白质的纯度。

主权项：1.一种Ranibizumab的纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：1亲和层析，填料为ProteinL琼脂糖凝胶；2酸性溶液环境孵育，孵育条件为pH：3.5～3.8，温度：18～25℃，孵育2～12小时；3羟基磷灰石层析，填料为CHTⅡ层析，a.样品处理：用平衡液将经过亲和层析后获得的洗脱液稀释一倍，缓缓加入2molLTris，至最终pH值为6.45～6.55，备用；b.柱平衡：用注射用水冲洗层析柱后，用2～3倍层析柱柱体积的再生液冲洗，再以平衡液平衡层析柱，平衡不少于2.5倍柱体积至柱前后电导、pH值一致；c.上样：将稀释后的亲和层析洗脱液经过羟基磷灰石层析柱d.上样后平衡：以平衡液过柱平衡不少于2.5个柱体积，至流出液紫外吸收回归基线并走平e.洗脱：洗脱溶液过柱洗脱，收集波长280纳米处紫外吸收的流出峰，为羟基磷灰石层析洗脱液；上述溶液成分：平衡液：5mmolL磷酸盐、5mmolL甘氨酸、0.14mmolL氯化钙、1％PEG-2000，pH6.45～6.55；再生液：400mmolL磷酸盐，pH6.3～6.7；洗脱溶液：5mmolL磷酸盐、5mmolL甘氨酸、0.14mmolL氯化钙、1％PEG-2000、0.20mmolL氯化钠,pH6.45～6.55；4阳离子交换层析，包括以下步骤：a.样品处理，经过羟基磷灰石层析后的含有目标蛋白质的洗脱液作为离子交换层析的样品，以1:1体积比稀释样品；b.平衡缓冲液平衡层析柱，以pH4.0～5.0的20mmolL醋酸作为平衡缓冲液，以2～5倍的柱体积平衡层析柱；c.样品流经层析柱，上样，将经过处理的样品经过离子交换层析柱，使其与离子交换填料相互作用；d.上样后，平衡缓冲液再次平衡层析柱，以pH4.0～5.0的20mmolL醋酸作为平衡缓冲液，以2～5倍的柱体积再次平衡层析柱；e.清洗，以pH5.0～6.0、含有50mmolL氯化钠的20mmolL醋酸，为清洗液，以9～13倍柱体积进行清洗；f.洗脱以pH6.0～7.5，50mmolL的磷酸盐缓冲液作为洗脱液，检测紫外吸收，收集目标蛋白质洗脱液；5过滤。

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