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申请/专利权人：重庆医科大学附属第一医院

摘要：本发明提供一种P24病毒样颗粒的佐剂与抗原共价偶联的制备方法，包括：通过分子生物学和分子克隆等实验技术构建pCDNA3.4‑P24载体，转染293T细胞表达和收集P24VLPs，分别共价偶联模式抗原OVAt、肿瘤抗原TRP‑2，制备P24VLPs‑OVAt、P24VLPs‑TRP‑2疫苗。本发明通过制备佐剂、抗原一体的疫苗，能够有效增强免疫系统对抗原的识别，从而增强免疫系统对不易被发现肿瘤的杀伤，显著增强癌症疫苗的临床抗肿瘤作用，制备更为高效和稳定的抗原递送系统和释放的佐剂系统。

主权项：1.一种P24病毒样颗粒的佐剂与抗原共价偶联的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1）.准备P24VLPs：获得NC_0001802.1的cDNA序列，克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.4上，构建pcDNA3.4-P24表达载体；转染至HEK293细胞瞬时表达，然后收集细胞上清，进行超速离心收集P24VLPs；步骤（2）.活化P24VLPs表面：使用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺活化P24VLPs表面上的官能团；步骤（3）.制备抗原：合成长为9个能拼接在一起的氨基酸的肽段，纯度大于90%；步骤（4）.活化抗原表面：对抗原进行活化处理，以暴露出反应基团，使用的活化试剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺；步骤（5）.共价连接：将步骤（2）中P24VLPs加入到圆底烧瓶中，补加1×PBS使蛋白终浓度为15mgmL；将准备好的戊二醛溶液滴加P24VLPs蛋白体系中，室温搅拌反应1h；用1×PBS于4℃下透析6h，除去游离的戊二醛；将步骤（4）中抗原肽用1×PBS溶液溶解；用Ellman试剂检测抗原肽中的巯基：在96孔板中加入100μL抗原肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412nm下测其紫外吸收值，如果OD值大于015则做下一步；将多肽液滴加到VLPs-戊二醛中，室温下用垂直混匀反应4h；用Ellman试剂检测抗原肽中的氨基：在96孔板中加入100μLEllman试剂储备液，再加入10μL交联后的抗原肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412nm下测定紫外吸收值；步骤（6）纯化：采用透析、柱层析或凝胶电泳的方法对反应物进行纯化，以去除未反应的交联试剂和其他杂质；步骤（7）鉴定和验证：通过SDS-PAGE凝胶电泳、透射电镜、WB和免疫荧光对纯化的产物进行鉴定和验证，确认P24VLPs与抗原已成功共价连接；步骤（8）稳定性测试：P24VLPs-OVAt和P24VLPs-TRP-2的粒径和zeta电位的检测：取约0.2mL样品，置于5mL离心管中，加入1mL水，超声分散5min取1mL上层溶液，缓慢加入样品池中，避免样品池内出现气泡；采用马尔文激光粒度仪ZS90进行测试，仪器预热30min；启动测试软件，选择Zeta测试程序，选择水为溶剂，25℃下预热30s后测定，每个样品平行测定3次。

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