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一种高效且适于不同接头连接的微量cfDNA建库方法及试剂盒 

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申请/专利权人:奥明星程(杭州)生物科技有限公司

摘要:本发明提供一种高效且适于不同接头连接的微量cfDNA建库方法及试剂盒,所述建库方法包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和测序与分析模块处理;本发明所述方法构建文库的效率显著提升,较商业化试剂盒提高1倍;不同起始量样本,文库产出均一性高;兼容不同结构接头,包括Illumina平台Y型接头和Hairpin接头,以及MGI平台Bubble接头,均可高效连接;保留更多原始模板,分析指标偏好性低。

主权项:1.一种高效且适于不同接头连接的微量cfDNA建库方法,其特征在于,包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和测序与分析模块处理;所述末端修复模块处理的具体操作如下:A1将cfDNA样本吹打混匀3-5次,吸取1ng至PCR管中,用无核酸酶水补足体积至50ul;B1将末端修复缓冲液解冻,末端修复酶混合物颠倒混匀,瞬时离心,置于冰上备用;所述末端修复缓冲液为1×的T4多聚核苷酸激酶缓冲液、20mM的ATP、20mM的dATP和2mM的dNTP组成的混合物;或者1×的NEB2缓冲液、20mM的ATP、20mM的dATP和2mM的dNTP组成的混合物;C1在cfDNAPCR管中,按如下体积加入试剂: 组分 体积ul 样本 25-50 末端修复缓冲液 3.5-7 末端修复酶混合物 1.5-3 总计 30-60 D1吹打混匀20次,瞬时离心收集至管底;E1将PCR管置于PCR仪中,进行下述反应,热盖105℃,20℃30min,65℃30min,4℃保存;F1反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底,放置冰上,并立即进行下一步实验;所述接头连接模块处理具体操作如下:A2将连接缓冲液解冻,快速连接酶颠倒混匀,瞬时离心后将试剂置于冰上备用;DNA接头原液稀释60倍;B2在样本管中配制如下反应: 组分 体积ul 末端修复产物 60 连接缓冲液 30 快速连接酶 10 DNA接头 10 总计 110 C2吹打混匀20次,瞬时离心收集至管底;D2将PCR管置于PCR仪中,进行下述反应,热盖105℃,20℃15min;E2反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底,放置冰上;F2使用DNA磁珠对反应产物进行纯化;所述PCR标签模块处理具体操作如下:A3将PCR扩增引物预混液和高保真聚合酶预混液解冻后颠倒混匀,于灭菌PCR管中配制如下反应: 组分 体积ul 上一步纯化产物 20 PCR扩增引物预混液 2.5-10 高保真聚合酶预混液 12.5-50 总计 50 B3吹打混匀20次,瞬时离心收集至管底;C3将PCR管置于PCR仪中,进行下述反应: D3反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底,放置冰上;E3使用DNA磁珠对反应产物进行纯化。

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