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申请/专利权人：奥明星程(杭州)生物科技有限公司

摘要：本发明提供一种适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和文库质检模块，原料组分简单，不需要复杂操作，重复性佳，对样本需求量少。本发明数据偏好性低，灵敏度和特异性高，可有效避免“误诊”和“漏诊”。本发明通过将血液cfDNA作为一种辅助癌症患者早期筛查的手段，可以作为影像学等的补充以解决现有技术诊断癌症敏感性不足的问题；利用本发明所述试剂盒经高通量测序后，能够有效检出单癌泛癌早期患者基因水平变异信息，有效辨别癌症良性和恶性，并且发现使用1‑2ml血液即可达到10ml血液检测效果，从而减少采血量。

主权项：1.一种适用于癌症早期检测的微量cfDNA建库方法，其特征在于，包括末端修复模块处理、接头连接模块处理、PCR标签模块处理和测序与分析模块处理；所述末端修复模块处理具体操作如下：A1将cfDNA样本吹打混匀3-5次，吸取1ng至PCR管中，用无核酸酶水补足体积至50ul；B1将末端修复缓冲液解冻，末端修复酶混合物颠倒混匀，瞬时离心，置于冰上备用；C1在cfDNAPCR管中，按如下体积加入试剂： 组分 体积ul 样本 25-50 末端修复缓冲液 3.5-7 末端修复酶混合物 1.5-3 总计 30-60 D1吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；E1将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应，热盖105℃，20℃30min，65℃30min，4℃保存；F1反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上，并立即进行下一步实验；所述接头连接模块处理具体操作如下：A2将连接缓冲液解冻，快速连接酶颠倒混匀，瞬时离心后将试剂置于冰上备用；DNA接头原液稀释60倍；B2在样本管中配制如下反应： 组分 体积ul EndPrep产物 60 连接缓冲液 30 快速连接酶 10 DNA接头 10 总计 110 C2吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；D2将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应，热盖105℃，20℃15min；E2反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上；F2使用DNA磁珠对反应产物进行纯化；所述PCR标签模块处理具体操作如下：A3将PCR扩增引物预混液和高保真聚合酶预混液解冻后颠倒混匀，于灭菌PCR管中配制如下反应： B3吹打混匀20次，瞬时离心收集至管底；C3将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应： D3反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，放置冰上；E3使用DNA磁珠对反应产物进行纯化。

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