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申请/专利权人：江苏集萃未来食品技术研究所有限公司;江南大学

摘要：本发明公开了一种高效生产3‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。通过在大肠杆菌的motA位点、fliR位点以及aptI位点整合α1,3‑岩藻糖基转移酶，敲除ptsG、lacZ以及编码转录阻遏物的基因lacI，用Ptac替换lacY的天然启动子，在flgG位点增加一个拷贝的lacY；敲除wcaJ、pfkA、nudD、lon，强化表达rcsA；在外源α1,3‑岩藻糖基转移酶其N端添加促溶标签SUMO并整合进基因组，最后通过在途径酶manB，manC上添加互作短肽RIAD，再转入带有互作短肽RIDD无序蛋白FUSN或RGG表达质粒获得了可高效生产3‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其胞外3‑FL的积累量最高达到13gL。

主权项：1.一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包括以下改造：敲除了葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因ptsG、β-半乳糖苷水解酶基因lacZ、转录阻遏物基因lacI、6-磷酸果糖激酶1基因pfkA、十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ、蛋白Lon基因lon、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD，分别在基因组上motA位点、fliR位点和aptI位点整合α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2，并在thrW位点整合含有SUMO标签的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2，在基因组上lacI位点整合由Ptac启动的乳糖渗透酶基因lacY，在基因组上flgG位点整合由Ptac启动的乳糖渗透酶基因lacY、由Ptac启动的DNA结合转录激活蛋白基因rcsA以及分别融合第一互作短肽的磷酸甘露糖变位酶基因manB和α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manC，以及表达了融合第二互作短肽的无序蛋白FUSN；所述第一互作短肽和第二互作短肽可特异性结合；所述第一互作短肽为短肽RIAD，第二互作短肽为短肽RIDD，葡萄糖特异性PTS酶IIBC组分基因ptsG的GeneID:945651，β-半乳糖苷水解酶基因lacZ的GeneID:945006，转录阻遏物基因lacI的GeneID:945007，6-磷酸果糖激酶1基因pfkA的GeneID:948412，十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaJ的GeneID:946583，蛋白Lon基因lon的GeneID:945085，GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD的GeneID:946559，α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，乳糖渗透酶基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，DNA结合转录激活蛋白基因rcsA的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，磷酸甘露糖变位酶基因manB的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manC的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，无序蛋白FUSN的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示。

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