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申请/专利权人：杭州唯铂莱生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，其包括：通过聚合酶链式反应分别扩增出目标基因片段G1和G2，然后将G1连接到载体的NheI和PmlI位点之间，构建质粒P1，G2连接到另一个载体的NdeI和PmlI位点之间，构建质粒P2的步骤；和，扩增出目标基因片段G3的步骤；和，将G3连接到P1的AscI和PmlI位点之间或P2的BsrGI和PmlI位点之间，获得重组质粒P3的步骤；和，将P1、P2或P3与包含NpgA基因片段的质粒P4共转化导入标准菌株ATCC208288，得到基因工程菌的步骤；通过合理设计并重新构建基因工程菌，更有效地生产非核糖体多肽。

主权项：1.一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于，其包括：以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，通过聚合酶链式反应分别扩增出具有AscI位点的目标基因片段G1和具有BsrGI位点的目标基因片段G2，然后将G1连接到载体的NheI和PmlI位点之间，构建质粒P1，G2连接到另一个载体的NdeI和PmlI位点之间，构建质粒P2的步骤；和，以P1和P2为模板，通过重叠延伸PCR技术，扩增出目标基因片段G3的步骤；和，将G3连接到P1的AscI和PmlI位点之间或P2的BsrGI和PmlI位点之间，获得重组质粒P3的步骤；和，将P3与包含NpgA基因片段的质粒P4共转化导入标准菌株ATCC208288，得到基因工程菌的步骤；和将基因工程菌进行培养发酵，提取，得到非核糖体多肽活性产物的步骤；其中，包括的具体步骤为：1构建重组质粒P1：C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA：①以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物bbBeas-F:5′-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3′，下游引物bbBeas-R:5′-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3′，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeas，扩增反应的条件为：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分钟，36个循环；②利用限制性核酸内切酶NheI和PmlI将步骤①扩增得到的目标基因片段连接到pESC-URA载体上的NheI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA；2构建重组质粒P2：C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA：Ⅰ以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物bbBsls-F:5′-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3′，下游引物bbBsls-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsls，扩增反应的条件为：95℃40秒，63℃40秒，72℃15.5分钟，36个循环；Ⅱ利用限制性核酸内切酶NdeI和PmlI将上述扩增得到的基因片段连接到pESC-URA载体上的NdeI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA；3通过以下A、B、C、D、E或F步骤构建重组质粒P3；AA1.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5′-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3′，上游片段下游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS-R:5′-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3′，下游片段上游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS-F:5′-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3′，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5′-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3′，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′；得到目标基因片段AscIbbBeaswithT2aT2bC3bbBsls；A2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤A1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTbbBeasT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA；BB1.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5′-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3′，上游片段下游引物BbBEASwithT2bC3BbBSLS-R:5′-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3′，下游片段上游引物BbBEASwithT2bC3BbBSLS-F:5′-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3′，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5′-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3′，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′；得到目标基因片段AscIbbBeaswithT2bC3bbBsls；B2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤B1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2abbBeasT2bC3bbBslsinpESC-URA；CC1.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5′-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3′，上游片段下游引物BbBEASwithC3BbBSLS-R:5′-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3′，下游片段上游引物BbBEASwithC3BbBSLS-F:5′-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3′，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5′-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3′，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3′；得到目标基因片段AscIbbBeaswithC3bbBsls；C2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤C1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bbbBeas-C3bbBslsinpESC-URA；DD1.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5′-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3′，上游片段下游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAS-R:5′-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3′，下游片段上游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAS-F:5′-ccaaagctatcaaaaagacgaagaaaaagaagcc-3′，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3′；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5′-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3′，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3′；得到目标基因片段BsrGIbbBslswithT2aT2bC3bbBeas；D2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤D1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTbbBslsT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA；EE1.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5′-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3′，上游片段下游引物BbBSLSwithT2bC3BbBEAS-R:5′-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3′，下游片段上游引物BbBSLSwithT2bC3BbBEAS-F:5′-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3′，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3′；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5′-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3′，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3′；得到目标基因片段BsrGIbbBslswithT2bC3bbBeas；E2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤E1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2abbBslsT2bC3bbBeasinpESC-URA；FF1.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5′-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3′，上游片段下游引物BbBSLSwithC3BbBEAS-R:5′-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3′，下游片段上游引物BbBSLSwithC3BbBEAS-F:5′-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3′，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3′；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5′-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3′，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5′-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3′；得到目标基因片段BsrGIbbBslswithT2bC3bbBeas；F2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤F1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bbbBsls-C3bbBeasinpESC-URA；4构建重组质粒P4：NpgAinpESC-TRP：α以纯化的EmericellanidulansATCC38163菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物NpgA-NdeI-5:5′-aaCATATGgtgcaagacacatcaag-3′，下游引物NpgA-PmeI-3:5′-aaGTTTAAACttaggataggcaatt-3′，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段NpgA，扩增反应的条件为：95℃40秒，63℃40秒，72℃1.1分钟，30个循环；β利用限制性核酸内切酶NdeI和PmeI将步骤α扩增得到的目标基因片段连接到pESC-TRP载体上的NdeI和PmeI位点之间，得到重组质粒NpgAinpESC-TRP；5构建工程菌株：将步骤3通过A、B、C、D、E或F得到的重组质粒与步骤4得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株；6提取非核糖体多肽活性产物：将步骤5中获得的工程菌株培养进行培养，收集培养液并通过色谱分析柱进行洗脱，得到非核糖体多肽活性产物；其中，步骤3的A、B、C、D、E和F步骤中，重叠延伸PCR技术的扩增反应的条件均为：第一轮：95℃40秒，63℃40秒，72℃2分钟，30个循环；第二轮：95℃40秒，58℃40秒，72℃3分钟，40个循环；其中，步骤5中，通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将步骤3通过A、B、C、D、E或F得到的重组质粒与重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中；其中，步骤6中，将步骤5中获得的工程菌株培养在含有1％葡萄糖的YPD培养基中，在温度30℃，转速250rpm的条件下震荡培养3天，得到培养液；将培养液用等体积的乙酸乙酯提取，得到提取液；将提取液进行减压蒸干后，放入MCI色谱分析柱中，进行梯度洗脱，收集含有非核糖体多肽活性产物的组分用乙腈水溶液进行洗脱纯化，得到非核糖体多肽活性产物；其中，将提取液进行减压蒸干后，放入MCI色谱分析柱中，依次用体积比为0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱；其中，所述非核糖体多肽活性产物为新型环状化合物或恩镰孢菌C，所述新型环状化合物的化学结构式为： 其化学式为C60H76N4O12。

全文数据：一种非核糖体多肽活性产物的获得方法技术领域[0001]本发明涉及一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，属于基因工程技术领域。背景技术[0002]非核糖体多肽是通过非核糖体途径合成的一系列低分子量、具有多种药用价值的多肽类次生代谢产物，在化学结构和生物活性上都具有丰富多样性。自然界中已经发现了一千多种非核糖体多肽化合物，包含多种抗生素、毒素、免疫抑制剂、生物表面活性剂、激素和抗肿瘤物质等。自然界中真菌能够合成许多种真菌毒素，像是白僵菌素、类白僵菌素、恩镰孢菌素等，这些天然物质大都具有广泛的生物学活性，如抗菌、杀虫、除草、抗逆转录以及化学增敏等活性，还有一些被证明能够抑制阿兹海默症中老年斑的形成以及抑制新生肿瘤形成等。这些真菌毒素就是非核糖体多肽中重要的一大类。但是从自然界中获得可合成以上物质的野生菌非常困难且产量少。所以目前获取工艺几乎为通过化工获取，化工方式的缺陷为产量低，工艺复杂，生物方式合成产量高，且可控，但菌株获得困难。[0003]以生物的方式指导合成非核糖体多肽需要经由一类称为非核糖体多肽合成酶来完成，它是一类大的多酶复合物，由一系列被称为模块的重复催化单位和结构单位所组成，具有广泛的催化底物特异性，适合于新型化合物分子的工程化生物合成。充分了解这些酶的催化机制有利于通过人工途径获得非核糖体多肽，也是合成新型化合物的关键。发明内容[0004]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，通过合理设计并重新构建基因工程菌，更有效地生产非核糖体多肽。[0005]实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到:一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，其包括：[0006]以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，通过聚合酶链式反应分别扩增出具有AscI位点的目标基因片段Gl和具有BsrGI位点的目标基因片段G2,然后将Gl连接到载体的NheI和PmlI位点之间，构建质粒Pl，G2连接到另一个载体的NdeI和PmlI位点之间，构建质粒P2的步骤;和，[0007]以Pl和P2为模板，通过重叠延伸PCR技术，扩增出目标基因片段G3的步骤;和，[0008]将G3连接到Pl的AscI和PmlI位点之间或P2的BsrGI和PmlI位点之间，获得重组质粒P3的步骤;和，[0009]将P1、P2或P3与包含NpgA基因片段的质粒P4共转化导入标准菌株ATCC208288,得到基因工程菌的步骤;和[0010]将基因工程菌进行培养发酵，提取，得到非核糖体多肽活性产物的步骤。[0011]作为优选，1构建重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA:[0012]①以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：[0013]上游引物bbBeas-F:5'-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3'，[0014]下游引物bbBeas-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'，[0015]通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_eas，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C15.5分钟，36个循环；[0016]②利用限制性核酸内切酶NheI和PmlI将步骤①扩增得到的目标基因片段连接到pESC-URA载体上的NheI和PmlI位点之间，得到重组质粒CiAiTiG^MTI^a^bCWbbBeasinpESC-URA；[0017]2构建重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_也inpESC-URA:[0018]I以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：[0019]上游引物bbBsls-F:5_aaCATATGgagccacccaacaacgc_3，[0020]下游引物bbBsls-R:S'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-S'，[0021]通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsis，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C15.5分钟，36个循环；[0022]Π利用限制性核酸内切酶NdeI和PmlI将上述扩增得到的基因片段连接到pESC-URA载体上的NdeI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_sisinpESC-URA;[0023]3通过以下六3、：、04或?步骤构建重组质粒；[0024]A[0025]Al.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_easinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0026]上游片段上游引物BbBEAS-Asc17195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0027]上游片段下游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS-R:5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3',[0028]下游片段上游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS广F:5，_cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3J，[0029]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCAOGTGtaaagacgcattcaaagcct_3'；[0030]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0031]上游片段上游引物BbBEAS-Asc17195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0032]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCAOGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；[0033]得到目标基因片段AscIbbBeaswithT2aT2bC3_sis;[0034]A2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤Al中得到的目标基因片段连接到重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTbbBeasT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA;[0035]B[0036]BI.以步骤I得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3_easinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBSisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0037]上游片段上游引物BbBEAS_AscI7195_F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0038]上游片段下游引物BbBEASwithT2bC3BbBSLS-R:5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3J，[0039]下游片段上游引物BbBEASwithT2bC3BbBSLS_F:5'_ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3J?[0040]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCAOGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；[0041]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0042]上游片段上游引物BbBEAS-Asc17195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0043]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；[0044]得到目标基因片段AscIbbBeaswithT2bC3_sis;[0045]B2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤BI中得到的目标基因片段连接到重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2abbBeasT2bC3bbBslsinpESC-URA;[0046]c[0047]Cl.以步骤I得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3_easinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBSisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0048]上游片段上游引物BbBEAS-Asc17195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0049]上游片段下游引物BbBEASwithC3BbBSLS广R:5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3'，[0050]下游片段上游引物BbBEASwithC3BbBSLS-F:5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3'，[0051]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCAOGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；[0052]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0053]上游片段上游引物BbBEAS-Asc17195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0054]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCAOGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；[0055]得到目标基因片段AscIbbBeaswithC3bbBsls;[0056]C2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤Cl中得到的目标基因片段连接到重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2aT2bbbBeas广C3bbBslsinpESC-URA;[0057]D[0058]Dl.以步骤1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_easinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBSisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0059]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0060]上游片段下游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAs-R:5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg_3,，[0061]下游片段上游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAs-F:5'_ccaaagctatcaaaaagacgaagaaaaagaagcc-3J?[0062]下游片段下游引物BbBEAS-B-RnlI-wostop-R:5'-aaCAOGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0063]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0064]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0065]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlIiostop-R:5'-aaCAOGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0060]得到目标基因片段BsrGIbbBslsWithT2aT2bC3bbBeas;[0067]D2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤Dl中得到的目标基因片段连接到重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBSisinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTbbBslsT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA;[0068]E[0069]El.以步骤1得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3_easinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBSisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0070]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0071]上游片段下游引物BbBSLSwithT2bC3BbBEAs-R:5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag_3,，[0072]下游片段上游引物BbBSLSwithT2bC3BbBEAs-F:5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtd，[0073]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0074]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0075]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0076]下游片段下游引物BbBEAS-B-Pmll-wostop-R:5'-aaCAOGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0077]得到目标基因片段BsrGIbbBslswithT2bC3bbBeas;[0078]E2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤El中得到的目标基因片段连接到重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBSisinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2abbBslsT2bC3bbBeasinpESC-URA;[0079]F[0080]Fl.以步骤I得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒CiAiTiC2A2MTT2aT2bC3bbBSisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0081]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0082]上游片段下游引物BbBSLSwithC3BbBEAs广R:5'-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3'，[0083]下游片段上游引物BbBSLSwithC3BbBEAs-F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3J，[0084]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCAOGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0085]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0086]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0087]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'_aaCA0GTGcaaagccgag1:ttagactct-3'；[0088]得到目标基因片段BsrGIbbBslswithT2bC3bbBeas;[0089]F2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤Fl中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2aT2bbbBsls广C3bbBeasinpESC-URA;[0090]4构建重组质粒NpgAinpESC-TRP:[0091]α以纯化的EmericellanidulansATCC38163菌株DNA为模板，使用引物组合：[0092]上游引物NpgA-Nde1-5:5，_aaCATATGgtgcaagacacatcaag_3'，[0093]下游引物NpgA-PmeI-3:5'-aaGTTTAAACttaggataggcaatt-3'，[0094]通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段NpgA，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C1.1分钟，30个循环；[0095]β利用限制性核酸内切酶NdeI和PmeI将步骤α扩增得到的目标基因片段连接到pESC-TRP载体上的NdeI和PmeI位点之间，得到重组质粒NpgAinpESC-TRP;[0096]5构建工程菌株：[0097]将步骤1得到的重组质粒、步骤2得到的重组质粒或步骤3通过六3、：、04或?得到的重组质粒与步骤4得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株；[0098]6提取非核糖体多肽活性产物：[0099]将步骤5中获得的工程菌株培养进行培养，收集培养液并通过色谱分析柱进行洗脱，得到非核糖体多肽活性产物。[0100]再优选地，3的A、B、C、D、E和F步骤中，重叠延伸PCR技术的扩增反应的条件均为：第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环；第二轮:95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环。[0101]再优选地，步骤5中，通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将步骤3通过A、B、C、D、E或F得到的重组质粒与重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中。[0102]再优选地，步骤6中，将步骤5中获得的工程菌株培养在含有1%葡萄糖的YPD培养基中，在温度30°C，转速250rpm的条件下震荡培养3天，得到培养液；[0103]将培养液用等体积的乙酸乙酯提取，得到提取液；[0104]将提取液进行减压蒸干后，放入MCI色谱分析柱中，进行梯度洗脱，收集含有非核糖体多肽活性产物的组分用乙腈水溶液进行洗脱纯化，得到非核糖体多肽活性产物。[0105]再优选地，将提取液进行减压蒸干后，放入MCI色谱分析柱中，依次用体积比为0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱。[0106]相比现有技术，本发明的有益效果在于：[0107]1、本发明通过合理设计并重新构建基因工程菌，更有效地生产非核糖体多肽；[0108]2、本发明方法具有产物可控的特点，稳定生产非核糖体多肽、产物产率高、不受原料限制、操作过程易控制、生产成本低。附图说明[0109]图1为实施例18的质谱图；[0110]图2为实施例19的质谱图；[0111]图3为实施例20的质谱图；[0112]图4为实施例23的质谱图。具体实施方式[0113]下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：[0114]实施例1[0115]实施例1用于说明质粒Pl的构建过程。[0116]构建重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAPl:[0117]①以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：[0118]上游引物bbBeas-F:5'-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3'，[0119]下游引物bbBeas-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'，[0120]通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_easG2，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C15·5分钟，36个循环；[0121]②利用限制性核酸内切酶NheI和PmlI将步骤①扩增得到的目标基因片段连接到pESC-URA载体上的NheI和PmlI位点之间，得到重组质粒CiAiTiG^MTI^a^bCWbbBeasinpESC-URAPl〇[0122]其中，目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeas已编入国际基因库，登录号为EU886196。[0123]实施例2[0124]实施例2用于说明质粒P2的构建过程。[0125]构建重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisinpESC-URAP2:[0126]I以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：[0127]上游引物bbBsls-F:5_aaCATATGgagccacccaacaacgc_3，[0128]下游引物bbBsls-R:S'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-S'，[0129]通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisG2，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C15·5分钟，36个循环；[0130]Π利用限制性核酸内切酶NdeI和PmlI将上述扩增得到的基因片段连接到pESC-URA载体上的NdeI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_sisinpESC-URAP2。[0131]其中，目标基因片段C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsis已编入国际基因库，登录号为FJ439897。[0132]实施例1~2中：Beauveriabassiana菌株购自美国标准生物品收藏中心ATCC，编号为ATCC7159;pESC-URA载体（pESC-URAVector购自安捷伦科技公司（AgilentTechnologies，货号为217454;DNA聚合酶、限制性核酸内切酶NheI、NdeI和PmlI购自宝生物工程大连有限公司；引物组合经设计后由生工生物工程上海股份有限公司生产。[0133]实施例3~8[0134]实施例3~8用于说明以Pl和P2为模板，通过重叠延伸PCR技术，扩增出目标基因片段G3的步骤;和，将G3连接到Pl的AscI和PmlI位点之间，获得重组质粒P3的步骤。[0135]实施例3[0136]Al.以实施例1得到的重组质粒CWTiC^^MTI^hbCWbbBeasinpESC-URAPl和实施例2得到的重组质粒[0137]C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3AbBsisinpESC-URAP2为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0138]上游片段上游引物BbBEAS-Asc17195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，上游片段下游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS-R:[0139]5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3',[0140]下游片段上游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS-F:[0141]5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3',[0142]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:[0143]5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct_3'；[0144]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0145]上游片段上游引物BbBEAS_AscI7195_F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:[0146]5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct_3'；[0147]扩增反应的条件为：第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环；第二轮：95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环；得到目标基因片段（AscIbbBeaswithT2bC：BbbBsisG3〇[0148]A2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤Al中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAPl的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTbbBeasT2aT2bC3bbBslsinpESC-URAP3。[0149]实施例4[0150]BI·以实施例1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAPl和实施例2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_sisinpESC-URAP2为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0151]上游片段上游引物BbBEAS_AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0152]上游片段下游引物BbBEASwithT2bC3BbBSLS-R:[0153]5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3',[0154]下游片段上游引物BbBEASwithT2bC3BbBSLS-F:[0155]5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3',[0156]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:[0157]5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；[0158]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0159]上游片段上游引物BbBEAS_AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0160]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:[0161]5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct_3'；[0162]扩增反应的条件为：第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环；第二轮：95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环；得到目标基因片段（AscIbbBeaswithT2aT2bC3bbBslsG3〇[0163]B2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤BI中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAPl的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2abbBeasT2bC3bbBslsinpESC_URAP3O[0164]实施例5[0165]Cl.以实施例1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAPl和实施例2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_sisinpESC-URAP2为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0166]上游片段上游引物BbBEAS_AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0167]上游片段下游引物BbBEASwithC3_Sls-R:[0168]5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3',[0169]下游片段上游引物BbBEASwithC3_Sls-F:[0170]5,_acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc_3,，[0171]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:[0172]5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct_3'；[0173]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0174]上游片段上游引物BbBEAS_AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3'，[0175]下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:[0176]5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct_3'；[0177]扩增反应的条件为：第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环；第二轮：95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环；得到目标基因片段（AscIbbBeaswithC3bbBslsG3。[0178]C2.利用限制性核酸内切酶AscI和PmlI将步骤Cl中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAPl的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2aT2bbbBeas广C3bbBslsinpESC_URAP3O[0179]实施例6[0180]Dl.以实施例1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3inpESC-URAPl和实施例2得到的重组质粒[0181]C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_sisinpESC-URAP2为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0182]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0183]上游片段下游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAs-R:[0184]5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3',[0185]下游片段上游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAs-F:[0186]5'-ccaaagctatcaaaaagacgaagaaaaagaagcc-3',[0187]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:[0188]5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct_3'；[0189]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0190]上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0191]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:[0192]5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0193]扩增反应的条件为：第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环；第二轮：95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环；得到目标基因片段（BsrGIbbBslswithT2aT2bC3bbBeasG3D[0194]D2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤Dl中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒C1A1T1C2A2MTbbBslsT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAP3。[0195]实施例7[0196]El.以实施例1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3inpESC-URAPl和实施例2得到的重组质粒CiAiTiG^MTI^I^bCwbbBsiwinpESC-URAP2为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0197]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0198]上游片段下游引物BbBSLSwithT2bC3BbBEAs-R:[0199]5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3',[0200]下游片段上游引物BbBSLSwithT2bC3BbBEAs-F:[0201]5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3',[0202]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:[0203]5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0204]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0205]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0206]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:[0207]5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0208]扩增反应的条件为：第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环；第二轮：95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环；得到目标基因片段（BsrGIbbBslswithT2bG3bbBeasG3〇[0209]E2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤El中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2abbBslsT2bC3bbBeasinpESC-URAP3O[0210]实施例8[0211]Fl.以实施例1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URAPl和实施例2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3_sisinpESC-URAP2为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：[0212]上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0213]上游片段下游引物BbBSLSwithC3BbBEAs-R:[0214]5J-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3J，[0215]下游片段上游引物BbBSLSwithC3BbBEAs~F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3J，[0216]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlIiostop-R:[0217]5'_aaCACGTGcaaagccgagtttagactct_3'；[0218]再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：[0219]上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，[0220]下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlIiostop-R:[0221]5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；[0222]扩增反应的条件为:第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环;第二轮：95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环；得到目标基因片段（BsrGIbbBslswithC3bbBeasG3〇[0223]F2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和PmlI将步骤Fl中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2aT2bbbBsls广C3bbBeasinpESC_URAP3O[0224]实施例3~8中：所使用的限制性核酸内切酶AscI、BsrGI和PmlI均购自宝生物工程大连有限公司；引物组合经设计后由生工生物工程上海股份有限公司生产。[0225]实施例9[0226]实施例9用于说明质粒P4的构建过程。[0227]构建重组质粒NpgAinpESC-TRPP4:[0228]α以纯化的EmericellanidulansATCC38163菌株DNA为模板，使用引物组合：[0229]上游引物NpgA-Nde1-5:5，_aaCATATGgtgcaagacacatcaag_3'，[0230]下游引物NpgA-Pme1-3:5，-aaGTTTAAACttaggataggcaatt_3'，[0231]通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段NpgA，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C1.1分钟，30个循环；[0232]β利用限制性核酸内切酶NdeI和PmeI将步骤α扩增得到的目标基因片段连接到pESC-TRP载体上的NdeI和PmeI位点之间，得到重组质粒NpgAinpESC-TRPΡ4。[0233]实施例9中：目标基因片段NpgA已编入国际基因库，登录号为AAF12814;Emericellanidulans菌株购自美国标准生物品收藏中心（ATCC，编号为ATCC38163;pESC-TRP载体pESC-TRPVector购自安捷伦科技公司（AgilentTechnologies，货号为217453;DNA聚合酶、限制性核酸内切酶NdeI和PmeI购自宝生物工程大连有限公司；引物组合经设计后由生工生物工程上海股份有限公司生产。[0234]实施例10~17[0235]实施例10~17用于说明将Pl、P2或P3与包含NpgA基因片段的质粒P4共转化导入标准菌株ATCC208288，得到基因工程菌的步骤。[0236]实施例1〇[0237]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例1得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株37。[0238]实施例11[0239]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例2得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株42。[0240]实施例12[0241]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例3得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTbbBeasT2aT2bC3bbBsisinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株201。[0242]实施例13[0243]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例4得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2abbBeasT2bC3bbBsisinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株204。[0244]实施例14[0245]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例5得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bbbBeas-C3bbBsisinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinPESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株203。[0246]实施例15[0247]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例6得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTbbBsisT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株215。[0248]实施例16[0249]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例7得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2abbBsisT2bC3bbBeasinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株205。[0250]实施例17[0251]通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将实施例8得到的重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bbbBsis-C3bbBeasinpESC-URA与实施例9得到的重组质粒NpgAinPESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株224。[0252]实施例10~17中，标准菌株ATCC208288菌株购自美国标准生物品收藏中心ATCC，编号为ATCC208288。[0253]实施例18~25[0254]实施例18~25用于说明将基因工程菌进行培养发酵，提取，得到非核糖体多肽活性产物的步骤，并对非核糖体多肽活性产物进行检测。[0255]实施例18[0256]将实施例10中获得的工程菌株37培养在2L含有1%葡萄糖的YH培养基中，在温度30°C，转速250rpm的条件下震荡培养3天，得到培养液；[0257]所述Yro液体培养基中各组分用量分别是：lOgL酵母提取物；20gL蛋白胨;20gL葡萄糖;灭菌。[0258]将培养液用等体积的乙酸乙酯提取3次，合并提取液；[0259]将提取液进行减压蒸干后，放入MCI色谱分析柱中，并依次用体积比为0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，其中20:80的洗脱组分中包含目的化合物，收集含有目的化合物的洗脱组分。[0260]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由50:50逐渐提高到100:0;收集在8.3-8.8分钟流出液，最终从工程菌株37的培养液中分离得到27.8mgL纯的目的化合物。[0261]对目的化合物进行检测：[0262]并用Agilent6130单四极质谱仪在210nm下进行结构鉴定，并对该化合物进行核磁共振和质谱分析，核磁共振数据如表1所示：[0263]表1实施例18的核磁共振数据[0266]质谱图如图1所示，得到目的化合物的化学结构式为：化学式C45H57N3O9，实施例18中的得到的目的化合物为白僵菌素.，Beauvericin〇[0268]实施例19[0269]将实施例11中获得的工程菌株42培养并获得目的化合物，其中菌株的培养发酵、目的化合物提取步骤与实施例18相同。[0270]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由80:20逐渐提高到100:0;收集在15.3-15.8分钟流出液，最终从工程菌株42的培养液中分离得到10.6mgL纯的目的化合物。[0271]对目的化合物进行检测，检测步骤与实施例18相同，得到的核磁共振数据如表2所示：[0272]表2实施例19的核磁共振数据[0275]质谱图如图2所示，得到目的化合物的化学结构式为：[0276]七学式C48H84N4〇12,实施例19中得到的目的化合物为球孢交酯Bassianolide〇[0277]实施例20[0278]将实施例12中获得的工程菌株201培养并获得目的化合物，其中菌株的培养发酵、目的化合物提取步骤与实施例18相同。[0279]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由80:20逐渐提高到100:0;收集在13.0-13.5分钟流出液，最终从工程菌株201的培养液中分离得到3.2mgL纯的目的化合物。[0280]对目的化合物进行检测，检测步骤与实施例18相同，得到的核磁共振数据如表3所示：[0281]表3实施例20的核磁共振数据[0284]质谱图如图3所示，得到目的化合物的化学结构式为：[0285]化学式C6qH76N4O12，实施例20中得到的目的化合物为一种新的环状化合物，称为FXl。[0286]实施例21[0287]将实施例13中获得的工程菌株204培养并获得目的化合物，其中菌株的培养发酵、目的化合物提取步骤与实施例18相同。[0288]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由80:20逐渐提高到100:0;收集在13.0-13.5分钟流出液，最终从工程菌株204的培养液中分离得到3.8mgL纯的目的化合物。[0289]对目的化合物进行检测，检测步骤与实施例18相同，检测结果与实施例21相同，亦得到目的化合物为新的环状化合物，称为FXl。[0290]实施例22[0291]将实施例14中获得的工程菌株203培养并获得目的化合物，其中菌株的培养发酵、目的化合物提取步骤均与实施例18相同。[0292]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由80:20逐渐提高到100:0;收集在13.0-13.5分钟流出液，最终从工程菌株203的培养液中分离得到3.5mgL纯的目的化合物。[0293]对目的化合物进行检测，检测步骤与实施例18相同，检测结果与实施例21相同，亦得到目的化合物为新的环状化合物，称为FXl。[0294]实施例23[0295]将实施例15中获得的工程菌株215培养并获得目的化合物，其中菌株的培养发酵、目的化合物提取步骤均与实施例18相同。[0296]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由80:20逐渐提高到100:0;收集在10.0-10.5分钟流出液，最终从工程菌株215的培养液中分离得到10.9mgL纯的目的化合物。[0297]对目的化合物进行检测，检测步骤与实施例18相同，得到的核磁共振数据如表4所示：[0298]表4实施例23的核磁共振数据LUJuuj质谐囹卯囹4所不，侍到目的化甘物的化字结构式73:[0301]学式C36H63N3O9,实施例23中得到的目的化合物为恩镰孢菌CEnniatinU〇[0302]实施例24[0303]将实施例16中获得的工程菌株205培养并获得目的化合物，其中菌株的培养发酵、目的化合物提取步骤均与实施例18相同。[0304]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由80:20逐渐提高到100:0;收集在10.0-10.5分钟流出液，最终从工程菌株205的培养液中分离得到10.lmgIii的目的化合物。[0305]对目的化合物进行检测，检测结果与实施例23相同，亦得到目的化合物恩镰孢菌CEnniatinC〇[0306]实施例25[0307]将实施例17中获得的工程菌株224培养并获得目的化合物，其中菌株的培养发酵、目的化合物提取、洗脱纯化及检测步骤均与实施例18相同。[0308]对目的化合物的洗脱组分进行洗脱纯化，目的化合物的洗脱组分在HPLC上用AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（5ym，250X4.6mm分离，用流速为lmLmin的添加有0.1%甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脱，在30分钟内，乙腈-水的体积比由80:20逐渐提高到100:0;收集在10.0-10.5分钟流出液，最终从工程菌株224的培养液中分离得到10.7mgL纯的目的化合物。[0309]对目的化合物进行检测，检测结果与实施例23相同，亦得到目的化合物恩镰孢菌CEnniatinC〇[0310]对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

权利要求：1.一种非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于，其包括：以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，通过聚合酶链式反应分别扩增出具有AscI位点的目标基因片段G1和具有BsrGI位点的目标基因片段G2,然后将G1连接到载体的Nhel和Pmll位点之间，构建质粒P1，G2连接到另一个载体的Ndel和Pmll位点之间，构建质粒P2的步骤;和，以P1和P2为模板，通过重叠延伸PCR技术，扩增出目标基因片段G3的步骤;和，将G3连接到P1的AscI和Pmll位点之间或P2的BsrGI和Pmll位点之间，获得重组质粒P3的步骤;和，将P1、P2或P3与包含NpgA基因片段的质粒P4共转化导入标准菌株ATCC208288,得到基因工程菌的步骤;和将基因工程菌进行培养发酵，提取，得到非核糖体多肽活性产物的步骤。2.如权利要求1所述的非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于包括以下步骤：1构建重组质粒CiAiTiG^MTI^hbCsbbBeasinpESC-URA:①以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物bbBeas_F:5'-aaGCTAGCatggagccgctcaaaaatgt-3'，下游引物bbBeas_R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段CiAiTiC-MTThl^CWbbBeas，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C15·5分钟，36个循环；②利用限制性核酸内切酶Nhel和Pmll将步骤①扩增得到的目标基因片段连接到pESC-URA载体上的NheI和PmlI位点之间，得到重组质粒bbBeasinpESC-URA;2构建重组质粒bbBsisinpESC-URA:I以纯化的BeauveriabassianaATCC7159菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物bbBsls_F:5'-aaCATATGgagccacccaacaacgc-3'，下游引物bbBs1s_R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段CiAiTiC-MTThl^CwbbBsis，扩增反应的条件为:95°C40秒，63°C40秒，72°C15·5分钟，36个循环；Π利用限制性核酸内切酶Ndel和PmlI将上述扩增得到的基因片段连接到pESC-URA载体上的NdeI和PmlI位点之间，得到重组质粒bbBsisinpESC-URA;3通过以下A、B、C、D、E或F步骤构建重组质粒；AA1.以步骤1得到的重组质粒CTiG^MTThl^bCwbbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒bbBsisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3',上游片段下游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS-R:5'-ggtgccgacttttgcaccatcgtcgtcgtccggg-3',下游片段上游引物BbBEASwithT2aT2bC3BbBSLS-F:5'-cccggacgacgacgatggtgcaaaagtcggcacc-3',下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3',下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；得到目标基因片段AscIbbBeaswithT2aT2bC3bbBsis;A2.利用限制性核酸内切酶AscI和Pmll将步骤A1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTbbBeasT2aT2bC3bbBslsinpESC-URA;BB1.以步骤1得到的重组质粒CTiG^MTThl^bCwbbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒bbBsisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3',上游片段下游引物BbBEASwithT2b〇3BbBSLS-R:5'-tctttcttgtcctggcctccaccaccattcaaag-3',下游片段上游引物BbBEASwithT2b〇3BbBSLS-F:5'-ctttgaatggtggtggaggccaggacaagaaaga-3',下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3',下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；得到目标基因片段AscIbbBeaswithT2bC3bbBsis;B2.利用限制性核酸内切酶AscI和Pmll将步骤B1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2abbBeasT2bC3bbBslsinpESC-URA;cCl.以步骤1得到的重组质粒CTiG^MTThl^bCwbbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒bbBsisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3',上游片段下游引物BbBEASwithC3BbBSLS-R:5'-gcatcggcggcgggaatgagttgaaacgcagtgt-3',下游片段上游引物BbBEASwithC3BbBSLS-F:5'-acactgcgtttcaactcattcccgccgccgatgc-3',下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBEAS-AscI7195-F:5'-aaactagatggcgcgccctggatatccgccgt-3',下游片段下游引物BbBSLS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGtaaagacgcattcaaagcct-3'；得到目标基因片段AscIbbBeaswithC3bbBsis;C2.利用限制性核酸内切酶AscI和Pmll将步骤Cl中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA的AscI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2aT2bbbBeas广C3bbBslsinpESC-URA;DD1.以步骤1得到的重组质粒CTiG^MTThl^bCwbbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒bbBsisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，上游片段下游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAS-R:5'-ggcttctttttcttcgtctttttgatagctttgg-3',下游片段上游引物BbBSLSwithT2aT2bC3BbBEAS~F:5'-ccaaagctatcaaaaagacgaagaaaaagaagcc-3',下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；得到目标基因片段BsrGIbbBslsWithT2aT2bC3bbBeas;D2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和Pmll将步骤D1中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBSlsinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTbbBslsT2aT2bC3bbBeasinpESC-URA;EEl.以步骤1得到的重组质粒CTiG^MTThl^bCwbbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒CiAiTiG^MTI^hbCsbbBsisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，上游片段下游引物BbBSLSwithT2b〇3BbBEAs-R:5'-gacccttgcttcgcttgaccaccaccggccgaag-3',下游片段上游引物BbBSLSwithT2b〇3BbBEAs-F:5'-cttcggccggtggtggtcaagcgaagcaagggtc-3',下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；得到目标基因片段BsrGIbbBslswithT2bC3bbBeas;E2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和Pmll将步骤El中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBSlsinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2abbBslsT2bC3bbBeasinpESC-URA;FFI.以步骤1得到的重组质粒CTiG^MTThl^bCwbbBeasinpESC-URA和步骤2得到的重组质粒bbBsisinpESC-URA为模板，通过重叠延伸PCR技术，进行两轮扩增，第一轮扩增使用的引物为：上游片段上游引物BbBSLS_BsrGI6843_F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3'，上游片段下游引物BbBSLSwithC3BbBEAs-R:5'-aaatcttcaacagacaagagctggaaggcagtgt-3',下游片段上游引物BbBSLSwithC3BbBEAs~F:5'-acactgccttccagctcttgtctgttgaagattt-3',下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；再以扩增得到的上游片段和下游片段的等比例混合物作为扩增模板，进行第二轮扩增，使用引物组合为：上游片段上游引物BbBSLS-BsrGI6843-F:5'-aaTGTACActtgcgcggctcagac-3',下游片段下游引物BbBEAS-B-PmlI-wostop-R:5'-aaCACGTGcaaagccgagtttagactct-3'；得到目标基因片段BsrGIbbBslswithT2bC3bbBeas;F2.利用限制性核酸内切酶BsrGI和Pmll将步骤FI中得到的目标基因片段连接到重组质粒C1A1T1C2A2MTT2aT2bC3bbBSlsinpESC-URA的BsrGI和PmlI位点之间，得到重组质粒ClAlTlC2A2MTT2aT2bbbBsls广C3bbBeasinpESC-URA;4构建重组质粒NpgAinpESC-TRP:α以纯化的EmericellanidulansATCC38163菌株DNA为模板，使用引物组合：上游引物NpgA-Ndel-5:5，-aaCATATGgtgcaagacacatcaag-3'，下游引物NpgA-PmeI-3:5，-aaGTTTAAACttaggataggcaatt_3'，通过聚合酶链式反应扩增目标基因片段NpgA，扩增反应的条件为：95°C40秒，63Γ40秒，72Γ1.1分钟，30个循环；β利用限制性核酸内切酶Ndel和Pmel将步骤α扩增得到的目标基因片段连接到pESC-TRP载体上的Ndel和Pmel位点之间，得到重组质粒NpgAinpESC-TRP;5构建工程菌株：将步骤1得到的重组质粒、步骤2得到的重组质粒或步骤3通过六3、：、04或?得到的重组质粒与步骤4得到的重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中，获得工程菌株；6提取非核糖体多肽活性产物：将步骤5中获得的工程菌株培养进行培养，收集培养液并通过色谱分析柱进行洗脱，得到非核糖体多肽活性产物。3.如权利要求2所述的非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于:3的A、B、C、D、E和F步骤中，重叠延伸PCR技术的扩增反应的条件均为:第一轮:95°C40秒，63°C40秒，72°C2分钟，30个循环;第二轮:95°C40秒，58°C40秒，72°C3分钟，40个循环。4.如权利要求2所述的非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于：步骤5中，通过聚乙二醇-醋酸锂介导的方法将步骤3通过六3、：、04或？得到的重组质粒与重组质粒NpgAinpESC-TRP共转化导入标准菌株ATCC208288中。5.如权利要求2所述的非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于：步骤6中，将步骤5中获得的工程菌株培养在含有1%葡萄糖的YPD培养基中，在温度30°C，转速250rpm的条件下震荡培养3天，得到培养液；将培养液用等体积的乙酸乙酯提取，得到提取液；将提取液进行减压蒸干后，放入MCI色谱分析柱中，进行梯度洗脱，收集含有非核糖体多肽活性产物的组分用乙腈水溶液进行洗脱纯化，得到非核糖体多肽活性产物。6.如权利要求5所述的非核糖体多肽活性产物的获得方法，其特征在于:将提取液进行减压蒸干后，放入MCI色谱分析柱中，依次用体积比为0:100、20:80、50:50和100:0的甲醇水溶液进行梯度洗脱。

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