申请/专利权人：安徽红杉生物医药科技有限公司

申请日：2024-03-08

公开（公告）日：2024-07-05

公开（公告）号：CN118291504A

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.07.05#公开

摘要：本发明公开了一种L‑苯甘氨醇的生物酶转化方法，包括构建重组载体1和重组载体2，应用于ω‑转氨酶与葡萄糖脱氢酶基因进行共表达提高酶活，转化反应过程中先加入胺供体、5‑磷酸吡哆醛PLP、R选择性ω‑转氨酶MVTA、葡萄糖脱氢酶BzGDH，随后流加2‑羟基苯乙酮固体至与反应底料的重量比达到1：0.5‑0.8时停止，之后一次性流加占反应体系体积2％‑7％的反应底物2‑羟基苯乙酮溶液DMSO，控制反应体系中溶液的pH值在8.6‑9.2，通过加入胺供体来调节溶液pH，通过中控监控反应终点，终止反应，得到转化液；通过使用重组的方法用于生产L‑苯甘氨醇，大大降低了发酵成本，同时也提高了酶活，且在生物转化过程中使用的菌体可回收进行二次使用，有利于节约成本。

主权项：1.一种L-苯甘氨醇的生物酶转化方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1：构建重组载体1：以ω-转氨酶基因MVTA设计一对引物Fp、Rp，序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示：Fp：GGAGAGAATTCATGGGCATCGACACTGEcoRI；Rp：GCCGGTCGACTTTAGGCCGCGTACTGASalI；下划线表示酶切位点碱基序列，以vanbaalenii分枝杆菌基因组为模板，采用PCR的方法以Fp及Rp为引物扩增目的基因，将扩增获得的目的基因与质粒pET-28a用EcoRI和SalI分别进行酶切，通过凝胶电泳验证酶切效率，酶切完成后通过胶回收试剂盒回收目的条带，将回收的目的基因片断与载体片段按照3:1的摩尔比混合，室温孵育6-8h，随后将其转化到E.coliBL21DH5α中。涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取单菌落进行LB摇瓶培养，并进行酶切验证，验证正确后送生工进行测序。测序正确即为重组载体1；S2：构建重组载体2：以S1中构建重组载体1为模板，设计引物Fa、Ra扩增出T7启动子以及GDH序列。以S1中的方法将Fa、Ra扩增出的目的基因与S1中构建的重组载体1进行连接，构建重组载体2，并将构建成功的重组载体2转入E.coliBL21DH5α获得重组E.coliBL21DH5α，Fa、Ra的序列分别如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示，将验证正确的质粒转入E.coliBL21DE3中，获得新的菌种，培养收集菌体并冷藏保存；其中，Fa：ccgctcgagttatgtattcagatctagctggXhoI；Ra：ccgctcgagcttttaaccgcgacccgcttgaaaacXhoI；S3、将反应底物2-羟基苯乙酮溶液、胺供体异丙胺或R-苯乙胺、5-磷酸吡哆醛PLP、R选择性ω-转氨酶MVTA、葡萄糖脱氢酶BzGDH的发酵液混合进行转化反应pH＝9.0，反应过程中先加入胺供体异丙胺或R-苯乙胺、5-磷酸吡哆醛PLP、R选择性ω-转氨酶MVTA、葡萄糖脱氢酶BzGDH，随后流加2-羟基苯乙酮固体，当流加的2-羟基苯乙酮固体与所述反应底料的重量比达到1：0.5-0.8时，停止流加2-羟基苯乙酮固体；S4、之后一次性流加反应底物2-羟基苯乙酮溶液DMSO，流加的量为反应体系体积的2％-7％；S5、控制反应体系中溶液的pH值在8.6-9.2，且保持pH值不能下降到7.5，通过加入胺供体来调节溶液pH，通过中控监控反应终点，终止反应，得到转化液。

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