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申请/专利权人:北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院)
摘要:本发明涉及环状DNA合成技术领域,特别是涉及一种简单且高效的大eccDNA的合成方法。本发明提供的合成方法具有简单高效的优势,可用于合成含有多片段的eccDNA,且合成的eccDNA产量高,纯度高。
主权项:1.一种染色体外环状DNA的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:1以基因组DNA为模板,进行第一轮PCR扩增,得到待合成的染色体外环状DNA对应的一个或多个第一线性DNA片段;2以步骤1所述的第一线性DNA片段为模板,进行第二轮PCR扩增,得到扩增产物;所述扩增产物为至少两种第二线性DNA片段,且含有待合成的染色体外环状DNA的所有序列;以所述第二线性DNA片段在待合成的染色体外环状DNA的位置排序,相邻第二线性DNA片段两侧有15~25bp序列完全重叠;3采用无缝克隆的方式连接步骤2中的所有第二线性DNA片段,得到初级染色体外环状DNA;4以待合成的染色体外环状DNA全长序列设计两对5'端具有磷酸化修饰的引物,以步骤3所述初级染色体外环状DNA为模板,分别经第三轮PCR扩增反应,得到待合成的染色体外环状DNA全长序列对应的两个第三线性DNA片段;5利用DNA连接酶将步骤4得到的两个第三线性DNA片段连接,得到所述染色体外环状DNA。
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权利要求:
百度查询: 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) 一种简单且高效的大eccDNA的合成方法
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