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申请/专利权人：中国农业科学院植物保护研究所

摘要：本发明提供一种丽草蛉的滞育解除方法，包括以下步骤：1选取进入滞育状态的丽草蛉预蛹作为滞育解除对象；2将步骤1中选取的丽草蛉预蛹置于光周期0L:24D，温度5℃，持续处理≥60天，使丽草蛉解除滞育；3将步骤2中解除滞育的丽草蛉预蛹转移至温度26℃，光周期16L:8D的条件下，使丽草蛉恢复生长发育，化蛹并羽化为成虫，成虫羽化率达90％以上，平均羽化期为23天。本发明的有益效果是：精准控制丽草蛉的滞育解除时间，为多种农林害虫的生物防治提供充足的天敌产品，对丽草蛉的大规模扩繁，延长其产品货架期及在田间的防控作用时间，提高害虫防治效率等具有重要意义，可为丽草蛉的工厂化生产应用提供技术保障。

主权项：1.一种丽草蛉的滞育解除技术，其特征在于：该方法包括如下步骤：1）选取进入滞育状态的丽草蛉预蛹作为滞育解除对象；2）将步骤1）中选取的丽草蛉预蛹置于低温环境进行短期处理，所述低温环境条件为光周期0L:24D，温度为5℃，持续处理≥60天；3）将步骤2）中处理过的丽草蛉预蛹转移至温度为26℃，光周期为16L:8D的条件下，使丽草蛉解除滞育并羽化为成虫。

全文数据：一种丽草蛉的滞育解除技术技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种丽草蛉的滞育解除技术。背景技术[0002]近年来，随着现代农业耕作模式的变革，加之全球气候变化的综合结果，世界范围内农业病虫害种群结构及灾变规律等都出现了新变化。当前我国农业病虫害频繁爆发，每年因病虫害导致的作物产量损失约占总损失的10%-15%，同时，病虫害防治又长期过量使用化学农药，这对我国食品安全、生态安全和国民健康产生了严重威胁。因此，发展环保、有效、安全且可持续的害虫综合治理策略，对保障国家粮食生产安全、促进农业丰产增收及保护生态环境具有重要的经济、社会和生态效益。[0003]生物防治技术是一种环境友好型、可持续发展的防治策略，具备简便、有效、低能耗、无残留及可持续等多种技术优势，符合现代化农业发展需求。其中，利用天敌昆虫防治害虫是生物防治核心技术之一，可有效控制害虫发生，减少农药使用量，保障农作物生产安全，实现农业可持续发展。该技术已被欧洲、北美等发达国家广泛应用，取得了显著的防治效果和经济效益。[0004]目前，限制国内外天敌昆虫大规模生产应用的主要瓶颈问题是：天敌昆虫扩繁周期较长，存活期较短，产品不能长期贮存，长距离运输困难等，导致天敌产品出厂时间很难与害虫发生期一致，实际应用效果不理想。因此，调控天敌昆虫的发育进度具有重要的现实意义。实现昆虫发育进度的调控，恰好可以利用昆虫本身固有的遗传属性一一滞育。利用天敌昆虫的滞育，不仅可实现天敌昆虫发育进度的人工调控、延长产品货架期、实现远距离安全运输、提高天敌昆虫的防控作用时间，还能深入了解其季节性生物学、帮助发展和完善有效害虫治理策略。当前国内外大量应用的天敌昆虫产品，已基本掌握了诱导天敌昆虫进入滞育，维持及解除滞育的技术，能及时将生产出的天敌昆虫以滞育状态进行长时间贮存，在释放前再打破滞育使其进入正常发育状态来防治害虫，滞育调控技术已成为天敌昆虫生产和高效应用的核心技术之一。[0005]刚草龄'ChrysopaformosaBrauer属脉翅目，草龄·科，草龄·属，主要分布于欧洲和亚洲地区，在中国各省市广泛分布。该虫是一种优良的捕食性天敌昆虫，可捕食蚜虫、粉虱、蓟马、介壳虫、斑潜蝇幼虫、叶螨、鳞翅目卵及低龄幼虫等多种农林害虫，具有食谱广、食量大、生殖力高、寿命长、适应性强等诸多优点，其幼虫和成虫均可捕食防治对象，控害持久且效果显著，在农林害虫的生物防治中发挥了重要作用。近年来，草蛉受到了国内外的高度关注，且已在许多国家被成功应用，如美国、前苏联、英国、法国、加拿大、印度等。此外在美国、加拿大、荷兰等发达国家已实现了草蛉的商品化和规模化生产，并被大规模广泛应用，防控效果极其显著，取得了良好的经济、生态和社会效益。[0006]研究丽草蛉等天敌昆虫的滞育，明确其滞育虫态及敏感虫态，阐明环境因子光周期、温度等对其滞育的调控作用，通过人工调控光周期、温度等环境条件，掌握调控天敌昆虫滞育诱导、维持和解除的关键技术，可为解决天敌昆虫产品的贮存、运输和应用等提供重要的技术支撑和方法指导，实现天敌昆虫的周年规模化扩繁，对促进天敌昆虫产业化生产和大面积释放应用具有重要的现实意义。发明内容[0007]本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种丽草蛉的滞育解除方法，通过操控环境因子，如温度、光照时长、处理时长等，结合必要的处理措施，实现对优良捕食性天敌昆虫一一丽草蛉滞育解除的精准控制。[0008]本发明的目的通过下述技术方案予以实现。[0009]—种丽草蛉的滞育解除技术，该方法包括如下步骤：[0010]1选取进入滞育状态的丽草蛉预蛹作为滞育解除对象；[0011]2将步骤1中选取的丽草蛉预蛹置于低温环境进行短期处理，所述低温环境条件为光周期0-10L:14-24D，温度为0-10°C，持续处理彡60天；[0012]3将步骤2中处理过的丽草蛉预蛹转移至温度为26°C，光周期为16L:8D的条件下，使丽草蛉解除滞育并羽化为成虫。[0013]进一步，所述步骤1中选取的丽草蛉滞育预蛹为结茧后10日龄的茧。[00M]进一步，所述滞育解除在人工气候箱内进行。[0015]进一步，所述步骤3中的丽草蛉预蛹的滞育解除率为90%_95%，成虫平均羽化历期为23天。[0016]进一步，所述步骤2中光周期为0L:24D，温度为5°C，持续处理60天。[0017]本发明的有益效果为：[0018]将滞育态的丽草蛉预蛹置于5°C黑暗条件下处理60天，然后转移至正常发育条件26°C、16L:8D下，可使94%以上的个体在平均23天内解除滞育，羽化为成虫，进行正常的捕食、交配、产卵及繁殖等，发挥天敌昆虫产品的控害效能。利用这一技术，可精准控制丽草蛉的滞育解除，为农业害虫的生物防治提供充足天敌产品，也为丽草蛉的大规模扩繁应用，延长产品货架期及在田间的防控作用时间提供技术保障。具体实施方式[0019]下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。[0020]实验1丽草蛉滞育虫态及滞育调控操控时机的确定[0021]1.1供试虫源及饲养方法：[0022]豌豆修尾虫牙MegourajaponicaMatsumura采自云南，室内26°C、光周期16L:8DL每日光照时长16小时，黑暗时长8小时条件下，以蚕豆苗作为寄主植物连续饲养多代，建立稳定种群，作为供试虫源。[0023]丽草龄'ChrysopaformosaBrauer成虫采自中国农业科学院廊坊试验基地大田内，室内26°C、光周期16L:8D条件正常发育条件下，将成虫置于养虫笼60X60X60cm中以豌豆修尾蚜作为寄主连续饲养，建立稳定种群。正常发育条件下，自新羽化成虫产卵日起，每日定时收集新产卵24h内），将卵粒置于铺有折叠滤纸条的饲养盒29X20XIOcm内待试，每盒放置60粒卵。[0024]1.2实验方法[0025]本研究中所有实验条件除温度和光周期设置不同外，相对湿度和光照强度均相同，分别为RH70±5%，光照8000LX。[0026]在温度26±1°C、光周期16L:8D人工气候箱，宁波江南RXZ-500B条件下，以豌豆修尾蚜饲养丽草蛉，丽草蛉卵的收集方法同上，待卵孵化幼虫后，每日添加足量蚜虫进行饲喂。在丽草蛉的不同发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、预蛹和蛹六个虫态参照表1所示分别进行高温长光照L:26°C，16L:8D和低温短光照（S:20°C，8L:16D的诱导处理实验。待幼虫结茧5天后，将收集的茧转移至26°C，16L:8D条件下继续观察20天，超过20天仍未羽化者，于显微镜下解剖检查其虫态及存活状况，统计滞育率。每组处理茧数不少于100头。[0027]表1丽草蛉不同虫态感受高温长光照L:26°C，16L:8D和低温短光照S:20°C，8L:16D的滞育率[0028][0029]注:表中灰色条块为滞育诱导条件（20°C，8L:16D;白色条块为正常发育条件26°C，16L:8D。刚从卵中孵化出来的幼虫是1龄幼虫，1龄幼虫蜕皮后为2龄幼虫，2龄幼虫蜕皮后为3龄幼虫，预蛹是指老熟幼虫停止取食并结茧至蜕皮化蛹之前的发育阶段，预蛹蜕皮后即进入蛹期。卵、3个幼虫期、预蛹和蛹期这六个虫态均为全程诱导。[0030]1.3丽草蛉滞育虫态的确定[0031]通常已进入滞育的昆虫个体，即使短期内给予正常发育条件也不会继续发育至下一个虫态。因此，根据丽草蛉的发育历期，在其完成卵至成虫的整个发育阶段所需的天数后，待大部分成虫羽化完成，继续延长观察一段时间，凡未羽化的茧经解剖后，仍保持存活者，即认为是滞育态，存活虫态即为滞育虫态。26°C，16L:8D条件下，丽草蛉幼虫结茧后5天内将全部化蛹，20天内全部羽化为成虫。[0032]实验结果表明（表1，将丽草蛉不同发育阶段进行低温短光照（20°C，8L:16D处理后，转移至正常发育条件下继续发育20天，仍未羽化者，经解剖检查发现，存活个体均为预蛹。许多研究也表明，丽草蛉在我国北方地区以预蛹在茧内越冬，这与本实验的结果一致。由此可知，丽草蛉的滞育虫态为预蛹。[0033]1.4丽草蛉滞育的判断标准[0034]为保证丽草蛉滞育调控实验的准确性与科学性，本实验将采用统一的滞育判断标准。如上所述，丽草蛉以预蛹虫态在茧内滞育，一经进入滞育，即使短期内给予正常发育条件也不会化蛹。26°C，16L:8D条件下，丽草蛉幼虫结茧后5天内即全部化蛹，化蛹的标志是透过茧壳可见茧后下端有一团黑色的末龄幼虫蜕皮。根据国内外通用的滞育判断标准方法之一，即发育历期法，若将不同条件处理后的丽草蛉茧转移至26°C，16L:8D条件下继续发育10天2倍于正常发育个体完成化蛹的天数），仍未化蛹者，经解剖检查，存活个体即判定为滞育。该方法简便易行，准确性高，是一种可靠的判断丽草蛉滞育的标准。[0035]1.5丽草蛉滞育调控操控时机的确定[0036]实验结果如表1所示，丽草蛉的3龄幼虫感受滞育诱导刺激的关键敏感虫期，只有当3龄幼虫处于滞育诱导S:20°C，8L:16D条件下，丽草蛉才能被诱导进入滞育状态。只对3龄幼虫之前的不同发育阶段和3龄之后的发育虫态单独进行滞育诱导处理，无滞育个体出现，丽草蛉茧均能正常化蛹、羽化和产卵，这与所有发育阶段均处于正常发育条件下CK的结果一致，表明卵期、1龄幼虫、2龄幼虫，1-2龄幼虫和预蛹对低温短光照的诱导不敏感。但低温短光照对幼虫的诱导刺激作用具有积累效应，除对丽草蛉3龄幼虫进行诱导处理外，若1龄幼虫、2龄幼虫和（或预蛹也同时经历低温短光照刺激，对预蛹的滞育发生具有显著促进作用，滞育率可达100%。[0037]综合实验1结果，丽草蛉以预蛹在茧内滞育，其3龄幼虫对滞育诱导刺激条件的敏感性最强，从低龄幼虫期开始对丽草蛉进行滞育诱导将获得更多的滞育个体。因此，对丽草蛉进行滞育诱导的最佳操控时机为整个幼虫期和预蛹期，通过调控光周期和温度因子，可诱导100%的丽草蛉预蛹进入滞育状态。[0038]实验2.丽草蛉的滞育诱导实验[0039]2.1光周期和温度对滞育诱导的影响实验[0040]为测定光周期和温度对滞育诱导的影响，设两因素五水平的重复性试验，于人工气候箱（宁波江南RZX-500B型）内进行滞育诱导，5个光周期水平分别是8L:16D、10L:14D、121^:120、1礼:100、161^:80,3个温度水平分别为18°：、20°：和26°：。[0041]为测定短光照条件下温度对丽草蛉滞育诱导的影响，在短光照8L:16D条件下，设置7个温度水平分别为:18°C、20°C、22°C、24°C和26°C。[0042]实验方法为：26°C，16L:8D条件下收集初产卵（24h内），收集方法同前（实验1，1.1，每处理重复3次，每重复60粒卵。将卵置于上述实验处理条件下孵育，待卵孵化后，每日添加足量蚜虫饲喂，直至幼虫结茧，待结茧5日后，将茧转移至26°C，16L:8D条件下继续观察，经10天仍未化蛹者，于显微镜下解剖查明存活状态及虫态，统计总茧数、化蛹数、滞育数及死亡数，计算滞育率，结果取3次重复的平均值。[0043]2.2数据分析[0044]实验中所有数据统计分析，结果以平均数±标准误表示。将滞育率先进行反正弦平方根转化，然后用GraphPadPrismV6.03软件中ANOVA进行方差分析，差异显著性检验采用Tukey多重比较法。[0045]2.3结果分析[0046]1光周期对滞育诱导的影响[0047]不同光周期条件下丽草蛉的滞育率如表2所示。由表可知，丽草蛉预蛹的滞育率随光照时长缩短而显著升高，其滞育类型为典型的长光照反应型。[0048]温度为18°C时，短光照8L:16D条件下的滞育率最高，为100%;光照时长短于14h时，滞育率均可达90%以上;但光周期为L16:D8时，预蛹不发生滞育，滞育率为0。[0049]温度为20°C时，光周期的滞育诱导作用规律与18°C时相同。短光照8L:16D下的滞育率最高，达100%;光周期为10L:14D和12L:12D时，滞育率均接近95%，虽略有降低，但与8L:16D下的滞育率差异不显著;光照时长增至Hh时，预蛹滞育率显著下降，为63.8%;光照继续延长至16h时，预蛹滞育率为0。[0050]温度为26°C时，同样也是短光照时，预蛹的滞育率较高，光周期短于12L:12D时，滞育率均高于90%;但光周期延长时，滞育率显著下降，长光照16h条件下，无滞育个体出现。[0051]根据丽草蛉在18、20及26°C下的光周期反应曲线，通过计算光照时长和滞育率的关系，可得到各温度下的临界光周期分别为14.4,14.3,和12.9h，其临界光周期随温度升高逐渐缩短。[0052]各温度水平下，短光照时，预蛹滞育率均较高；而光照延长时，预蛹滞育率显著降低。当光周期短于12L:12D时，各温度下的滞育率均维持在较高水平，达90%以上;光周期延长至14L:IOD时，滞育率显著下降；长光照16L:8D时则完全不滞育。表明，光周期在丽草蛉预蛹滞育的诱导中具有决定作用。[0053]表2不同温度和光周期组合条件下丽草蛉的滞育诱导率[0054][0055]注:表中数据为平均值土标准误，同列不同小写字母表示差异显著P〈0.05。[0056]2温度对滞育诱导的影响[0057]如表2和表3所示，温度对丽草蛉预蛹的滞育诱导也具有显著影响，但其影响作用低于光周期的影响;温度对滞育诱导的光周期反应具有调节作用。[0058]同一光周期条件下，预蛹的滞育率均随温度升高略有下降。尤其在短光照8L:16D条件下，随温度升高，滞育率下降显著，但总体下降幅度不大，滞育率均高于90%。温度为18°C和20°C时，滞育率最高，为100%;温度升高至22°C和24°C时，滞育率明显下降，分别为96.7%和93.2%;温度为26°C时，滞育率降低为91.1%，显著低于18°C和20°C时的滞育率，但与22°C和24°C时的滞育率差异不显著。表明，低温可显著提高预蛹的滞育率，温度对光周期诱导的预蛹滞育具有一定调节作用。[0059]表3短光照8L:16D条件下不同温度对丽草蛉滞育诱导的影响[0060][0061]注:表中数据为平均值土标准误，同列不同小写字母表示差异显著P〈〇.05。[0062]3光周期和温度对滞育诱导的影响[0063]不同光周期和温度（18°C，20°C和26°C条件下滞育率的双因素方差分析结果表明，不仅光周期史4,3。=724.5，^=4，？〈0.001和温度史2,3。=47.53，^=2，？〈0.001均对丽草蛉的滞育诱导有显著影响，而且光周期和温度的交互作用显著F8,⑽=17.31，df=8，P〈0.001。预蛹在温光组合条件为18°C、8L:16D时滞育率均为100%，而温光组合条件为26°C、8L:16D时滞育率仍可达91.1%。表明，虽然低温对预蛹的滞育诱导具有促进作用，但光周期对预蛹滞育的发生起主导作用，温度伴随光周期起一定调节作用。[0064]综合实验2结果，光周期是决定丽草蛉滞育的主要环境因子，低于12h的每日短光照可诱导90%以上的预蛹进入滞育；温度对丽草蛉滞育具有一定调节作用，低温可进一步促进滞育发生，但温度的影响作用低于光周期的作用。将丽草蛉整个幼虫期饲养于短光照8L:16D、温度18°C或20°C条件下，直至其结茧，即可诱导100%的个体进入滞育态。在实际生产应用中，考虑到经济成本的因素，因18°C时幼虫发育缓慢，诱导进入滞育所需的时间较长表3，所以20°C、短光照8L:16D是诱导丽草蛉幼虫滞育的较优组合条件，既能在相对较短时间内诱导预蛹进入滞育，又能获得100%的滞育个体，在生产上更具实际意义。[0065]滞育维持是延长天敌昆虫产品贮存期的前提和基础，也是天敌昆虫发育调控和生产结合的关键环节。针对丽草蛉滞育维持和贮存方法的确定，申请人做了以下实验，该方法的各个步骤均可以从以下实验中得到验证。[0066]实验3丽草蛉的滞育解除试验[0067]3.1供试虫源及饲养方法:如前述实验1。[0068]3.2实验方法[0069]由前述实验2的结果可知，20°C、8L:16D条件下，丽草蛉的滞育诱导率最高，可达100%。故本试验选取该条件下诱导得到的丽草蛉滞育预蛹结茧后10日龄作为试验对象。将滞育预蛹分别进行如下处理：1直接置于26°C、16L:8D条件下对照组持续观察;2直接置于20°C、8L:16D条件下持续观察;3先置于0°C、全黑暗条件下分别处理10、30、60天后转入26°C、16L:8D条件下持续观察;4先置于5°C、全黑暗条件下分别处理30、60、90天后转入26°C、16L:8D条件下持续观察。上述处理过的丽草蛉，逐日观察并记录其成虫羽化时间、数量等，统计由转移茧日至成虫羽化所需时长和羽化率。若滞育茧能正常羽化，视为滞育解除个体，并将转移茧日至成虫羽化所需的时间作为滞育解除历期。各处理观察丽草蛉茧60头以上。[0070]3.3数据分析[0071]实验中所有数据统计分析，结果以平均数±标准误表示。羽化率的比较采用卡方检验;滞育解除历期先进行倒数转换，然后用GraphPadPrismV6.03软件中One-WayANOVA进行方差分析，差异显著性检验采用Tukey多重比较法。[0072]3.4结果分析[0073]不同温度和光照组合条件对丽草蛉滞育解除的影响如表4所示，由表可知，滞育预蛹均能在高温长光照条件26°C、16L:8D和中等温度短光照条件下（20°C、8L:16D解除滞育，但解除滞育所需的时间较长，滞育解除率较低，成虫羽化不整齐。在温光组合26°C、16L:8D条件下，滞育解除历期平均需72天，约50%的个体能解除滞育并羽化为成虫。20°C、8L:16D条件下，虽然滞育解除率相对较高，但是从预蛹解除滞育至成虫羽化所需时长显著延长，平均需要107天，成虫羽化的持续周期明显延长，不利于滞育的快速解除。[0074]表4.不同温光组合条件对丽草蛉滞育解除的影响[0075][0076]低温对丽草蛉滞育解除的影响如表4和表5所示，结果表明，零度低温不利于丽草蛉的存活和滞育解除，经〇°C处理一段时间再转移到适宜条件下，只有极少数个体能解除滞育并恢复生长发育，滞育解除率极低，且滞育解除所需时长较长。[0077]表5.低温TC对丽草蛉滞育解除的影响[0078][0079]经适度低温5°C短期处理后再转入正常发育条件下可显著促进丽草蛉的滞育解除进程。表6的结果表明，滞育预蛹在5°C下处理30天时，滞育解除率不足60%，从解除滞育至成虫羽化平均需要34.8天。当处理超过60天后，滞育解除率显著升高，可达85%以上，最高为94%，显著高于其他处理组;滞育解除历期也显著缩短，大部分可在21〜23天左右羽化为成虫；成虫羽化整齐度也明显升高，成虫可集中在15天内完成羽化。上述结果表明，丽草蛉预蛹解除滞育需要经历一定的低温刺激，但当低温处理时间太短时，往往不能完全解除滞育，导致部分个体在适宜条件下也无法恢复生长发育；只有当低温处理时间超过一定范围后5°C处理60天以上），才能使绝大部分丽草蛉解除滞育，并在短期内羽化为成虫。[0080]表6.低温5°C对丽草蛉滞育解除的影响[0081][0082]综合实验3结果，一定时间的适度低温处理可显著促进丽草蛉的滞育解除进度，从实际生产应用角度考虑，结合滞育解除率、滞育解除历期、成虫羽化整齐度、生命力等因素，将处于滞育态的预蛹，施以5°C、全黑暗条件、60天处理，然后转移至正常发育条件（26°C、16L:8D下，可使94%以上的个体在平均23天内解除滞育，羽化为成虫，进行正常的捕食、交配、产卵及繁殖等，发挥天敌昆虫产品的控害效能。[0083]以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

权利要求：1.一种丽草蛉的滞育解除技术，其特征在于:该方法包括如下步骤：1选取进入滞育状态的丽草蛉预蛹作为滞育解除对象；2将步骤1中选取的丽草蛉预蛹置于低温环境进行短期处理，所述低温环境条件为光周期0-10L:14-24D，温度为0-10°C，持续处理彡60天；3将步骤2中处理过的丽草蛉预蛹转移至温度为26°C，光周期为16L:8D的条件下，使丽草蛉解除滞育并羽化为成虫。2.根据权利要求1所述的丽草蛉的滞育解除技术，其特征在于:所述步骤1中选取的丽草蛉滞育预蛹为结茧后10日龄的茧。3.根据权利要求1所述的丽草蛉的滞育解除技术，其特征在于:所述滞育解除在人工气候箱内进行。4.根据权利要求1所述的丽草蛉的滞育解除技术，其特征在于:所述步骤3中的丽草蛉预蛹的滞育解除率为90%_95%，成虫平均羽化历期为23天。5.根据权利要求1所述的丽草蛉的滞育解除技术，其特征在于:所述步骤2中光周期为OL:24D，温度为5°C，持续处理60天。

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