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申请/专利权人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所

摘要：本发明提供用于鉴别DAdV‑3和DAdV‑A的引物和酶及其应用，属于鸭病学研究领域，采用了如SEQIDNO.1‑2所示的引物和SalⅠ酶，建立能够对我国鸭群中出现的两种鸭腺病毒（DAdV‑3和DAdV‑A）的鉴别诊断方法，该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外10min酶切后再进行常规琼脂糖凝胶电泳，简单实用、方便快捷，为在鸭群中开展腺病毒分子流行病毒学调查和科学防控相关疫病提供支撑，具有十分重要的研究意义。

主权项：1.一组用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶，其特征在于：所述引物如下：DAdV-3A-F1：5’-CATACMGYGGMACAGCTTACAATC-3’，DAdV-3A-R1：5’-ATCSCKAAAACCWATGTAGTTA-3’；所述酶为SalⅠ酶。

全文数据：用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用技术领域[0001]本发明属于鸭病学研宄领域，具体涉及用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用。背景技术[0002]腺病毒颗粒为无囊膜、核衣壳呈二十面体对称、线性、双链DNA病毒，其基因组全长约为33kd左右。其中，六邻体蛋白（Hexon是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，每个Hexon蛋白表面携带有病毒主要的属的种特异性抗原决定簇，是病毒中和抗体的祀目标，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。[0003]根据国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV的最新分类（https:talk.ictvonline.org，腺病毒科（Family:毒属Genus:Aviadenovirus、鱼腺病毒属Genus:Ichtadenovirus、哺乳动物腺病毒属Genus:Mastadenovirus和唾液酸酶病毒属Genus:Siadenovirus。[0004]研究发现，禽类中存在多种腺病毒感染，其中感染鸡的腺病毒有5种:禽腺病毒A型FowlaviadenovirusA，FAdV-A、禽腺病毒B型（FowlaviadenovirusB，FAdV-B、禽腺病毒C型（FowlaviadenovirusC，FAdV-C、禽腺病毒D型（FowlaviadenovirusD，FAdV-D、禽腺病毒E型FowlaviadenovirusE，FAdV-E，均属于禽腺病毒属。感染火鸡Turkey的腺病毒有4种，分别属于腺病毒科的两个属，其中火鸡腺病毒B型（TurkeyaviadenovirusB、火鸡腺病毒C型（TurkeyaviadenovirusC和火鸡腺病毒D型（TurkeyaviadenovirusD属于禽腺病毒属;而火鸡唾液酸酶病毒A型TurkeysiadenovirusA属于唾液酸酶病毒属。感染鹦鹉Psittacine的的腺病毒有2种，分别属于腺病毒科的两个属，其中鹦鹉富AT腺病毒属A型（PsittacineatadenovirusA属于富AT腺病毒属；而鹤銷腺病毒B型PsittacineaviadenovirusB属于禽腺病毒属。[0005]近年来，随着我国水禽尤其是鸭饲养规模的不断扩大，养殖模式的发展，水禽中新发疫病也越来越多、越来越复杂。鸭群中腺病毒感染也存在分属腺病毒科不同腺病毒属的相关报道，有属于富AT腺病毒属的鸭腺病毒A型（duckadenovirusA，缩写为DAdV-A。2014年，随着高通量技术的发展，MarekA等测定了1株鸭源腺病毒GR株，GenBank登录号NC024486全基因组序列，并将其命名为鸭腺病毒2型（duckadenovirus2，DAdV-2，并基于基因组特点和遗传进化特征将其归为禽腺病毒属成员MarekA，KajanGL,KosiolC，etal•Completegenomesequencesofpigeonadenovirus1andduckadenovirus2extendthenumberofspecieswithinthegenusAviadenovirus[J].Virology,2〇l4,462-463:l〇7_114.，随后ICTV将其科学命名为鸭腺病毒B型（duckaviadenovirusB，以区别属于富AT腺病毒属的DAdV-A。随后，2〇14年以来，在我国番鸭中出现一种新的鸭腺病毒CH-GD-2〇14株，GenBank登录号KR1351M，该病毒和DAdV_2分离株GR株存在以下明显区别：①其全基因组序列和GR株的核苷酸同源性仅为92•3%;②CH-GD-2〇14株和GI?株的Hexon基因的核苷酸同源性仅为76•6%，低于80.0%;③CH-GD-2014株有2个纤突蛋白（Fiberl、Fiber2，而GR株只有1个纤突蛋白（Fiber。基于上述特征表明，我国鸭群中流行一种新的鸭腺病毒，并将其命名为鸭腺病毒3型duckadenovirus3，DAdV_3周镇海•鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究[D]•华南农业大学硕士论文，2016.。这就给DAdV-3和DAdV-A带来现实需求，一般而言，对两个病原进行鉴别诊断，需要针对2个病原的分别设计引物（即共需要4条引物），来建立鉴别诊断方法。本研究基于DAdV-3和DAdV-A的Hexon基因保守区核苷酸序列特征，建立一种仅需2条引物即可DAdV-3和DAdV-A进行同时扩增，但在扩增区域存在Sail酶多态性差异（g卩PCR扩增区域存在Sail酶酶切位点差异），对酶切产物进行常规琼脂糖凝胶电泳即可有效区分。该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外l〇min酶切无需对产物进行胶回收后再进行电泳，简单实用、方便快捷，尤其可对DAdV-3和DAdV-A混合感染进行精准区分，当前尚未见基于类似原理的DAdV-3和DAdV-A的鉴别诊断的引物和酶的报道，本研究可填补相关研究领域空白。发明内容[0006]本发明的目的在于提供提供用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用，建立一种仅需2条引物即可DAdV-3和DAdV_A进行同时扩增，但在扩增区域存在Sail酶多态性差异（S卩PCR扩增区域存在Sail酶酶切位点差异），对酶切产物进行常规琼脂糖凝胶电泳即可有效区分。[0007]为实现上述目的采用以下技术方案：一组用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶，所述引物如下：DAdV-3A-Fl:5’-CATACMGYGGMACAGCTTACAATC-3’，DAdV-3A-Rl:5’-ATCSCKAAAACCWATGTAGTTA-3’；所述酶为Sail酶。[0008]本发明的另一目的是提供一种用于检测DAdV-3和DAdV-A的试剂盒，包括所述的引物和酶。[0009]按照DreamTaqGreenPCRMasterMix2X试剂盒推荐的的5〇uL体系进行扩增，其中2XPCRMasterMix扩增反应液25yL、10yM引物DAdV_3A-Fl和DAdV-3A-Rl分别为1.0此、提取的核酸模板DAdV-3、DAdV-A各1.0此、补充灭菌去离子水至终体积5〇此，混匀后进行PCR扩增。[0010]扩增条件为95T预变性3min后进入循环，95-C变性30s、AT52。062。〇退火30s、72°C延伸35s，40个循环结束后，72°C终延伸10tnin，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。AT52°C-62°C表示退火温度在此区间进行优化。经优化后的最佳退火温度为56°C。[0011]本发明的优点在于：本发明基于DAdV_3和DAdV-A的Hexon基因保守区核苷酸序列特征，建立一种仅需2条引物即可DAdV-3和DAdV-A进行同时扩增，但在扩增区域存在Sa：LI酶多态性差异（g|]pcR扩增区域存在Sail酶酶切位点差异），对酶切产物进行常规琼脂糖凝胶电泳即可有效区分。该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外l〇min酶切后再进行电泳，简单实用、方便快捷，尤其可对DAdV_3和DAdV-A混合感染进行精准区分，当前尚未见基于类似原理的DAdV-3和DAdV-A的鉴别诊断的引物和酶的报道，本研宄可填补相关研究领域空白。附图说明[0012]图1上游引物设计区。[0013]图2下游引物设计区。[0014]图3DAdV-3和DAdV-A第459-465位核苷酸序列比较。[0015]图4PCR产物的电泳，其中M:DL2000分子量标准；l:DAdV-3;2:DAdV-A。[0016]图5特异性试验;M:DL2000分子量标准；1:DAdV-3;2:DAdV-A;3:DEV;4:MDPV;5:DuCV;6:GPV;7:E.coli;8:R.A.;9:P.M.;10:DAdV-2;11:灭菌去离子水。[0017]图6SalI酶酶切鉴定后的产物电泳，其中M1:DL500分子量标准;M2:DL2000分子量标准;1:DAdV-3产物酶切电泳;2:DAdV-A产物酶切电泳;3:DAdV-3和DAdV-A共感染产物酶切电泳。具体实施方式[0018]实施例11、材料1.1毒株和菌株试验用病原DAdV-3W1FJ株，GenBank登录号MH349774、DAdV-AFJ12025株，GenBank登录号KF286430由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。[0019]试验用对照毒株鸭肠炎病毒①EV、番鸭细小病毒MDPV、鸭圆环病毒DuCV、鸭源鹅细小病毒GPV;试验用对照菌株鸭大肠杆菌E.coli、鸭疫里氏杆菌R.A.和鸭源禽多杀性巴氏杆菌（P.M.，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。鸭腺病毒2型DAdV-2的Hexon基因GR株，GenBank登录号NC024486序列全长由生工生物工程上海股份有限公司合成。[0020]1.2引物设计根据美国国家生物技术信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI数据库GenBank上腺病毒科DAdV-3代表株:CH-GD_2014株KR135164、W1GD株（MH349773、fflFJ株（MH349774、W1AH株（MH349775和DAdV-A代表株：E05株EF532411、FJ12025株（KF286430、DU-JW-012株KJ452170、DU-JW-017株KJ452171的Hexon基因，利用LasergeneDNAStarMegAlign进行核苷酸系列分析比对，确定DAdV-3和DAdV-A基因保守区分别作为上游引物设计区（图1和下游引物设计区（图2。[0021]利用引物设计软件Oligo7.0设计一套引物，如下：DAdV-3A-Fl:5’-CATACMGYGGMACAGCTTACAATC-3’，DAdV-：3A-Rl:5’-ATCSCKAAMCCWATGTAGTTA-3’。上述引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成。[0022]需要指出的是，在使用DAdV-3A-FlDAdV-3A-R1对DAdV-3和DAdV-A进行扩增时，DAdV_3和DAdV-A的PCR产物目的条带大小分别为524bp和521bp常规琼脂糖电泳，肉眼无法有效区分）。但是在DAdV-3和DAdV-A的扩增区域内存在特征性的SalI酶酶切位点差异，其中DAdV_3在第459-妨5位核苷酸序列为GTCGAC可被Sail酶识别），而DAdV-A在扩增区域内没有可被SalI酶识别的位置，序列比对结果见图3。[0023]1.3主要试剂DreamTaqGreenPCRMasterMix2X购自ThermoScientific公司，EasyPureGenomicDNAKit、EasyPureBacteriaGenomicDNAKit均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA分子量标准DL500、DNA分子量标准DL2000和QuickCutSalI酶均购自宝日医生物技术北京有限公司。[0024]试验方法的建立2.1基因组DNA的提取0八沢-3、0八狀-八、0£7、]^^乂、011：¥、6?¥按照£3丫?11作6611〇111。0腿灯1:试剂盒的方法提取相应的基因组DNA，-80°C冻存备用。[0025]E.coli、R_A•和P.M•按照EasyPureBacteriaGenomicDNAKit试剂盒的方法提取相应的基因组DNA，-8TC冻存备用。[0026]2.2反应液的配置和退火温度的优化按照DreamTaqGreenPCRMasterMix2X试剂盒推荐的的50uL体系进行扩增，其中2XPCRMasterMix扩增反应液25uL、引物DAdV-3A-Fl和DAdV-3A-RllOuM分别为1.0uL、提取的核酸模板DAdV-3、DAdV-A各1•0uL、补充灭菌去离子水至终体积5〇uL，混匀后进行PCR扩增。[0027]扩增条件为95°C预变性3min后进入循环，95°C变性30s、AT52°C-62。0退火30s、72°C延伸35s，40个循环结束后，72°C终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。AT52H2°C表示退火温度在此区间进行优化，经优化后的最佳退火温度为56°C。[0028]结果可见（图4，当模板仅加入DAdV-3时，出现大小为524bp的条带（第1泳道）；当模板仅加入DAdV-A时，出现大小为521bp的条带第2泳道），常规琼脂糖电泳肉眼无法区分。[0029]2.3特异性试验将优化后的PCR体系和扩增条件，对DEV、MDPV、DuCV、GPV、E.co1i、R•A.和P.M.以及灭菌去离子水对照进行扩增，均未见扩增条带。结果见图5，DEV第3泳道）、MDPV第4泳道）、DuCV第5泳道）、GPV第6泳道）、E.coli第7泳道）、R.A.第8泳道）和P.M•第9泳道）、DAdV-2第10泳道和灭菌去离子水第11泳道），表明建立的方法特异性强，对常见水禽病原均无交叉反应。[0030]2.4酶切鉴定将PCR产物利用Sail酶进行酶切鉴定，酶切体系为30UL体系:其中10XQuickCutGreenBuffer3uL、QuickCut™SalI酶3uL、PCR产物20uL，补充灭菌去离子水至终体积3〇uL。轻轻混匀后瞬时离心，37°C水浴反应10min。结果可见图6，DAdV-3产物有两条，大小分别为101bp和423bp第1泳道）；DAdV-A产物大小不变，仍然是52lbp第2泳道）；DAdV-3和DAdV-A产物有三条，大小分别为521bp，423bp和101bp第3泳道）。[0031]临床应用对49份临床送检鸭源病料按照常规方法研磨处理后，利用EaSyPureGenomicDNAKit提取相应的核酸DNA，利用优化后的方法进行DAdV-3和DAdV-A感染的检测。PCR产物经SalI酶酶切后进行常规琼脂糖凝胶电泳，结果可见，检测到9份DAdV-3感染阳性，阳性率为18•37%;检测到5伤DAdV-A感染阳性，阳性率为i〇•20%;检测到2份DAdV-3和DAdV-A共感染阳性，阳性率为4.08%。[0032]J^PCR反应结束后的阳性目的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒DP2〇9,天根生化科技北京有限公司分别进行切胶回收。按照pEASY-TlSimpleCloningKit克隆连接试剂盒CT111-01，北京全式金生物技术有限公司）说明书将丑找如基因片段克隆到pEASY_T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素含量为1〇〇ngmL抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒DP105,天根生化科技北京有限公司）提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物和条件对提取的质粒分别进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术北京有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的DAdV-3和DAdV-A的Hexon基因片段，其中DAdV-3阳性片段和DAdV-3W1FJ株，GenBank登录号MH349774的Hexon基因同源性在".〇%以上；DAdV-A阳性片段和DAdV-AFJ12025株，GenBank登录号KF286430的Hexon基因同源性在99.0%以上。上述测序结果和PCR检测结果的符合率均为1〇〇%。[0033]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

权利要求：1.一组用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶，其特征在于:所述引物如下：DAdV-3A-Fl:5’-CATACMGYGGMACAGCTTACAATC-3,，DAdV-3A-R1:5’-ATCSCKAAAACCWATGTAGTTA-3’；所述酶为Sail酶。2.—种用于检测DAdV-3和DAdV-A的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和酶。

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