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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明公开了一种鉴定单增李斯特菌12c血清型的NASBA检测引物及方法，属于生物技术领域。正向引物序列为5’‑GAAATACATTTTGGTCTAG‑3’，反向引物序列为5’‑aattctaatacgactcactatagggATTACTGGGAATAACTTGA‑3’，单增李斯特菌12c血清型检测用分子信标探针序列为5’‑JOE‑CGATCGAGGAAATGCTTATGCAGATATTACGATCG‑DABCYL‑3’，检测方法包括下列步骤：单增李斯特菌RNA提取，实时NASBA反应，定性分析。本发明构建的引物和分子信标对单增李斯特菌12c血清型菌株的鉴定具有高度的特异性和灵敏度，所述的检测方法操作步骤简单，检测时间短，可进行实时定性分析，并且可对活菌和死菌有效区分。

主权项：1.一种鉴定单增李斯特菌12c血清型的NASBA检测方法，其特征在于，该方法用于非疾病诊断性检测，所述NASBA检测方法特异性引物序列如下：正向引物NM2c-F序列为5’-GAAATACATTTTGGTCTAG-3’，反向引物NM2c-R序列为5’-aattctaatacgactcactatagggATTACTGGGAATAACTTGA-3’；所述NASBA检测方法用分子信标探针MB2c，其序列为5’-JOE-CGATCGAGGAAATGCTTATGCAGATATTACGATCG-DABCYL-3’。

全文数据：鉴定单増李斯特菌12c血清型的NASBA检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种鉴定单增李斯特菌l2c血清型的NASBA检测方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]在单增李斯特菌的13个血清型中，l2a、l2b、l2c和4b血清型菌株是最常从食品及临床病例中分离出的。据报道在中国分布的食源性单增李斯特菌大部分为l2c血清型，相比较于其他血清型，l2c血清型菌株能在室温、富营养或低营养、偏碱等食品加工及销售常见环境条件下生存，产生污染食品的物质，如生物被膜，易导致食源性李斯特菌病发生，因此建立能快速、有效、准确的单增李斯特菌血清型鉴定方法是十分必要的。[0003]在检测活菌感染时，由于DNA的稳定性，即使细胞死亡，它仍能在检测体系中产生不必要扩增信号，会干扰实验结果。因此近年来，研究者开始将RNA分子作为靶点来检测和鉴定细胞的活性。由于mRNA和rRNA半衰期较短，比DNA更适合于活细胞检测。但是如果将mRNA用作靶点分子，则必须保证其反应过程中能进行转录。NASBA是以单链RNA序列为靶点的一步法恒温扩增反应，适合用于活菌检测。目前NASBA技术在国内外已广泛应用于病毒、细菌等检测，在我国NASBA已作为禽流感病毒的国标检测方法开始使用，NASBA检测方法有研究，多是以电泳直接检测扩增结果或者是结合ELISA，而基于分子信标的实时NASBA检测食源性致病菌的方法鲜有报道。发明内容[0004]技术问题[0005]本发明提供了一种基于NASBA技术对单增李斯特菌l2c血清型RNA具有特异性识别作用的引物和分子信标探针，同时利用该引物和分子信标探针构建一种快速、方便、准确的鉴定单增李斯特菌l2c血清型的NASBA检测方法。[0006]技术方案[0007]一种鉴定单增李斯特菌l2c血清型的NASBA检测方法，其特征在于，所述NASBA检测方法特异性引物序列如下：[0008]正向引物NM2C-F序列为·[0009]反向引物匪2c_R序列为-3,；[0010]所述NASBA检测方法用分子信标探针MB2C，其序列为5’-J0E-，所述的分子信标探针在5’端标记荧光报告集团J〇E，3’端标记荧光淬灭集团DABCYL。[0011]所述NASBA检测方法包括以下步骤：[0012]1单增李斯特菌RNA提取[0013]收集对数后期的菌悬液细胞，加入溶菌酶，采用Trizol法进行RNA提取。将所得到的RNA溶液置于-70°C保存；[0014]2实时NASBA反应[0015]将反应溶剂和KCl溶液混匀，备用，在八联管中加入RNA模板，再加入反应混合液，同时加入引物和分子信标，混匀;65°C加热2min，41°C温浴2min，迅速加入酶混合液，41°C反应90min，每2min收集一次荧光信号，以NASBA水作为空白对照；[0016]⑶定性分析[0017]反应结果通过Ct值来判断，Ct值大于35则为阴性，Ct值小于35则为阳性。[0018]所述NASBA反应体系如下：试剂体积（pLReagent4.0κα溶液1.5ΓΊNM2C-FR0.4[0019]MB2c0.4Enzyme2.0RNA1.7Total10«[0020]有益效果[0021]本发明适用于食品样品，尤其是禽肉制品。本发明所述的引物、分子信标及检测方法特异性较强，能够从背景复杂的样品中检测出目标菌，灵敏度高，对目标菌的检测限到IOkgAiL级，同时可以有效、准确的区分活的和死的单增李斯特菌，在含有死菌的背景下实现对活菌包括VBNC状态）的快速检测。附图说明[0022]图1为实施例3中NASBA反应体系对新鲜培养的l2c血清型单增李斯特菌的检测结果。[0023]图中1〜4分别为静置培养Oh，6h，12h，24h;CK为空白对照[0024]图2为实施例3中NASBA反应体系对VBNC状态的l2c血清型单增李斯特菌的检测结果。[0025]图中1〜4分别为静置培养Oh，6h，12h，24h;CK为空白对照[0026]图3为实施例3中NASBA反应体系对热致死的l2c血清型单增李斯特菌的检测结果。图[0027]中1〜4分别为静置培养Oh，6h，12h，24h;CK为空白对照具体实施方式[0028]下面通过实施例和附图的方式来说明和解释本发明，但本发明并不只是限制在所述的实施例范围。本实例中，所有引物和分子信标探针均交付上海生工生物工程技术服务有限公司合成。[0029]本发明所采用的引物和分子信标探针是基于比较基因组学和生物信息学方法，选取12个单增李斯特菌血清型和4个非单增李斯特菌的全基因组，将这些代表菌株的各编码基因分别通过Blastn程序进行比对，选取与目标基因同源性较高，同时与其他非目标菌菌株基因不具有同源性的基因作为其候选特异性靶点。根据序列比对发掘的候选特异性基因，利用软件ClustalXv2.0对这些基因序列进行同源性分析，找出其中的保守序列。通过软件PrimerPremier5.0设计引物，筛选评分高、自身无发夹结构、无二聚体产生的引物，在NCBI数据库再次进行Blastn比对分析，再通过在线生物信息工具“insilico”（http:insilico.ehu.esPCR模拟待选引物的PCR扩增结果，选择特异性高的引物合成验证革巴点基因的实际特异性。在筛选到的16个单增李斯特菌l2c血清型准特异性靶点基因中，利用BeaconDesign8.0、RNAstructure5.3和OligoWalk筛选适合用于NASBA反应的带有环状结构的靶点序列，并设计相应的特异性引物和分子信标。选取靶点基因保守序列中特异性较好的序列片段作为分子信标的杂交部分，分子信标的空间结构通过软件RNAstructure进行预测，并在5和3端位置添加CGATCG序列作为信标的颈部结构，在该结构的外侧再添加JOE荧光基团和DABCYL淬灭基团，并在分子信标序列的两侦U设计特异性引物，同时在下游引物的5端位置添加T7聚合酶识别位点，通过不同血清型的单增李斯特菌菌株RNA进行特异性验证。[0030]本发明一种用于鉴定单增李斯特菌12C血清型的NASBA检测方法，所述NASBA检测方法特异性引物序列如下：[0031]正向引物NM2C-F序列为£[0032]反向引物匪2c_R序列为；3,；[0033]所述NASBA检测方法用分子信标探针MB2c，其序列为5’-J0E-所述的分子信标探针在5’端标记荧光报告基团6_J0E，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL;[0034]所述NASBA检测方法包括以下步骤：[0035]1单增李斯特菌RNA提取[0036]收集对数后期的菌悬液细胞，加入溶菌酶200yL50mgmL，上海生工生物工程股份有限公司），使用ImLTrizol试剂（总RNA提取试剂，上海生工生物工程股份有限公司），按照产品说明书进行RNA提取。将所得到的RNA溶液置于-70°C保存。[0037]2实时NASBA反应[0038]将反应溶剂和KCl溶液（I.5yL，5mM，法国梅里埃生物公司）混匀，备用，在八联管中加入RNA模板，再加入反应混合液，同时加入引物和分子信标，混勾。65°C加热2miη，4TC温浴2min，迅速加入酶混合液，41°C反应90min，每2min收集一次荧光信号，以NASBA水作为空白对照；[0039]NASBA反应体系如下：试剂体积（μ:η终浓度（μΜΟ[0040]RcagcmC梅里4.0埃公司）KCl溶液1.5750NM2c-FR0.40.4MB2c0.4OA[0041]Enzyme梅里2.0埃公司）RNAI7Total10[0042]⑶定性分析[0043]反应结果通过Ct值每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数来判断，大于35即为阴性，小于35即为阳性。[0044]实施例1:NASBA检测方法的特异性验证[0045]以36株单增李斯特菌包括13个血清型，其中l2c血清型菌株有4株和24株非单增李斯特菌的RNA为模板，对建立的NASBA反应体系进行特异性评价。每个样品设置3个平行样，以NASBA水作为空白对照。反应结果通过Ct值来判断，大于35即为阴性，小于35即为阳性。检测结果如表2所示，结果表明，4株单增李斯特菌l2c血清型菌株能产生明显的荧光扩增信号，而其他非l2c血清型菌株未见荧光信号，反应呈阴性，说明建立的实时NASBA反应特异性良好。[0046]表2实验菌株及NASBA反应检测结果[0049]实例2NASBA反应体系的检测限测定[0050]1总RNA检测限测定[0051]将培养至对数期的单增李斯特菌l2c血清型菌株FSIS57115取ImL提取总RNA，通过核酸浓度测定仪测定总RNA的浓度，再以RNase-freeddH2〇进行连续10倍梯度稀释，进行实时NASBA反应。检测结果见表3。当单增李斯特菌浓度在13.8ngAiL〜13.8fgyL范围内时，NASBA检测体系能获得可信的阳性结果，此时荧光信号仍然很强。而当RNA浓度继续下降时，无法获得有效的Ct值，结果判定为阴性，该反应体系对单增李斯特菌l2c血清型总RNA的检测限为13.8fgyL。[0052]表3实时NASBA的RNA模板检测限测定[0054]⑵细菌菌落灵敏度评价[0055]将单增李斯特菌l2c血清型菌株FSIS57115培养至对数期，以平板计数计算其初始浓度，然后以生理盐水进行梯度稀释，每个稀释度取ImL菌液转接至BHI培养基中增菌8h，提取RNA进行NASBA反应，纯菌培养物的灵敏度分为未增菌和增菌后两部分进行。检测结果见表4。当菌液浓度大于1.92XIo1CFUAiL时，NASBA反应均能产生有效的Ct值，反应结果为阳性，该反应体系对未增菌的纯菌培养物的检测限为1.92XIo1CFUAiL;另一方面，取浓度为1.92X10—1CFlVmL〜1.92X104CFUmL接种于BHI培养基中，经过8h的增菌培养，NASBA检测体系对所有接种量的纯菌培养物都能获得有效的荧光阈值，该检测体系对增菌后的纯菌培养物的检测限为1.92XH^CFUmL。[0056]表4实时NASBA的未增菌纯菌培养物检测限测定[0058]实例3NASBA反应体系对鸡肉样品中活菌、热致死菌和VBNC菌的检测[0059]将单增李斯特菌l2c血清型菌株FSIS57115培养至对数期，取ImL菌液，以无菌生理盐水洗涤菌体两次后重悬，调整重悬菌液的细胞浓度为NX107CFUmL，将其作为活菌样本待检测。热致死菌采用沸水浴中处理15min的加热灭活方法制备，并通过平板计数确认该菌液样品无菌落产生。活的非可培养状态菌viablebutnon-culturable，VBNC以低温诱导方法进行。[0060]取冷冻鸡肉40g，通过国标法确定待污染的样品本身不含有单增李斯特菌。采用三种不同状态的单增李斯特菌对鸡肉进行人工污染，包括对数生长期菌、VBNC菌及热致死菌。将鸡肉分为4份，每份IOg分别与20mL三种不同状态菌液混合浸泡30min，无菌条件下滤干样品，将其密封包装好，放置于4摄氏度静置保存，然后在0h、6h、12h和24h时取样，用20mLPBS漂洗样品，200rpm震荡培养30min，取ImL液体提取RNA，进行NASBA反应。[0061]结果见图1-3。对于不同存放时间的活菌样本和VBNC菌样本，NASBA反应体系均能产生有效的荧光信号，活菌样本的荧光信号略强于VBNC菌的扩增信号，而在热致死菌检测样本中仅在灭活处理后出现扩增曲线，其阈值也是有效的，判定其检测结果为阳性，可能是由于微生物经过灭菌处理后，菌体中目标mRNA并未完全降解，所以导致该体系能检测到热致死菌的RNA信号。

权利要求：1.一种鉴定单增李斯特菌12C血清型的NASBA检测方法，其特征在于，所述NASBA检测方法特异性引物序列如下：正向引物NM2c-F序列为5’-GAAATACATTTTGGTCTAG-3’，反向引物NM2c_R序列为5’-aattctaatacgactcactatagggATTACTGGGAATAACTTGA-3’；所述NASBA检测方法用分子信标探针MB2c，其序列为5’-JOE-CGATCGAGGAAATGCTTATGCAGATATTACGATCG-DABCYL-3’，所述的分子信标探针在5’端标记荧光报告集团J〇E，3’端标记荧光淬灭集团DABCYL。2.根据权利要求1所述鉴定单增李斯特菌l2c血清型的NASBA检测方法，其特征在于，所述NASBA检测方法包括以下步骤：1单增李斯特菌RNA提取收集对数后期的菌悬液细胞，加入溶菌酶，采用Trizol法进行RNA提取，将所得到的RNA溶液置于_70°C保存；⑵实时NASBA反应将反应溶剂和KCl溶液混匀，备用，在八联管中加入RNA模板，再加入反应混合液，同时加入引物和分子信标，混匀；65°C加热2min，41°C温浴2min，迅速加入酶混合液，41°C反应90min，每2min收集一次荧光信号，以NASBA水作为空白对照；⑶定性分析反应结果通过Ct值来判断，Ct值大于35则为阴性，Ct值小于35则为阳性。3.根据权利要求1或2所述鉴定单增李斯特菌l2c血清型的NASBA检测方法，其特征在于，所述NASBA反应体系如下：试剂体积（μ!Reagent4,.0KCl溶液1.5NM2c-FR0.4MB2c0.4Enzyme2.0RNA1.7'TotalΙΟ»4.权利要求1-3所述鉴定单增李斯特菌l2c血清型的NASBA检测方法所用的特异性引物NM2c-FR〇5.权利要求1-3所述鉴定单增李斯特菌l2c血清型的NASBA检测方法所用的分子信标探针MB2c。

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