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申请/专利权人：金宇保灵生物药品有限公司

摘要：本发明公开一种基于IFA的BRV血清中和抗体效价水平的检测方法，属于生物技术领域。本发明提供的方法在IFA检测中和抗体的方法基础上采用两种含有不同浓度胰酶的DMEM维持液对临床血清样本进行两阶段2倍倍比稀释制备用于和BRV中和毒共孵育的待检血清样品，可以有效避免临床血清样本本身对胰酶的中和而对BRV在细胞中的生长的影响，从而准确检测BRV血清中和抗体效价水平，并且本发明提供的方法还具有快速的特点，可以有效用于指导BRV疫苗生产和质量监控。

主权项：1.一种基于IFA的BRV血清中和抗体效价水平的检测方法，其包括以下步骤：S1：制备系列二倍倍比稀释的待检血清样品；和S2：分别将等体积的BRV中和毒和步骤S1制备的系列二倍倍比稀释的待检血清样品的混合液接种MA104单层细胞，经固定液固定、加一抗、加二抗后进行荧光显微镜观察；其中步骤S1中所述制备系列二倍倍比稀释的待检血清样品的操作为：使用含有136～144μgml胰酶的DMEM维持液将临床血清样本按照2倍倍比稀释到1:16稀释度，之后再使用含有4～6μgml胰酶的DMEM维持液按2倍倍比稀释；其中步骤S2包括以下步骤：（1）接种：分别将等体积的BRV中和毒和步骤S1制备的系列二倍倍比稀释的待检血清样品在37±0.5℃下孵育55～65min，将孵育后的混合液分别接种到铺有MA104单层细胞的细胞板的孔中，再次培养46～50h，获得第一处理细胞板；（2）固定液固定：用预冷的丙酮液作为固定液对步骤（1）中的第一处理细胞板的孔中细胞进行固定，获得第二处理细胞板；（3）加一抗：向步骤（2）中的第二处理细胞板的孔中加入使用PBS按照1:800～1:1200比例稀释的BRV标准阳性血清作为一抗，于37±0.5℃孵育55～65min后，弃掉，使用PBS进行清洗，获得第三处理细胞板；（4）加二抗：向步骤（3）中的第三处理细胞板的孔中加入使用PBS按照1:800～1:1200比例稀释的羊抗鼠IGg-FITC作为二抗，于37±0.5℃孵育55～65min后，弃掉，使用PBS进行清洗，每孔再加入PBS避光保存，获得第四处理细胞板；（5）荧光显微镜观察：在荧光倒置显微镜下观察步骤（4）获得的第四处理细胞板中的各孔，以孔中只有1～2个细胞出现特异性荧光的孔所对应的待检血清样品的稀释度作为BRV血清中和抗体效价水平。

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