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申请/专利权人：吉林农业大学

摘要：本发明公开了一种Kefir粒人参发酵液及马克斯克鲁维酵母人参发酵液，Kefir粒人参发酵液，是按重量百分比将kefir粒接种到人参浆中发酵，发酵后稀有皂苷Rg3提高了134.7 %，人参皂苷Rd提高了104.5%，同时增加了人参果香味和烧烤香味；马克斯克鲁维酵母人参发酵液，是按重量百分比将马克斯克鲁维酵母接种到人参浆中发酵，发酵后人参皂苷Rg3含量为3.31mgg，同时产生特殊的香气；本发明利用Kefir粒发酵人参，食用安全，同时改善了人参口感，提高了稀有皂苷的含量，使人参药用价值更高、肠道吸收功能性强。

主权项： Kefir粒人参发酵液，它是由下述方法制备的：按重量百分比，将3‑6%kefir粒接种到人参浆中，26‑30℃条件下发酵60‑84h。

全文数据：Kefir粒人参发酵液技术领域[0001]本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及Kefir粒人参发酵液、马克斯克鲁维酵母人参发酵液。背景技术[0002]人参阜苷是人参PanaxginsengC.Mey.中主要生物活性成分之一，属于四环三萜皂苷，而皂苷化学结构是由苷元骨架和糖基，通过Glc-相连而形成的一种糖苷类化合物，因不同的苷元骨架与不同的糖基侧链形成了不同的人参皂苷，人参皂苷具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤和抗炎等多种功效。人参皂苷在自然生长人参中含量多少可分为分为主人参皂苷和稀有人参皂苷，稀有人参皂苷（如人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、人参皂苷CK等在抗肿瘤等方面具有更强的药理活性，将人参中含量丰富的人参皂苷Rbl、Rb2、Rc、Rd、此、1^1、1^等转化为药用价值更高、肠道吸收功能更强的稀有人参皂苷0^1、1^2、？12、Rg3、Rb3、Rh2、compoundK等成为现代研究的重点之一。稀有人参皂苷Rg3具有抑制肿瘤细胞增殖、浸润、转移作用，抑制胃癌诱导的血管内皮细胞增殖作用等备受关注。人参皂苷Rg3肿瘤细胞的抑制，首先是通过抑制肿瘤新血管生成。小剂量应用时即可产生，最适合预防肿瘤发生和肿瘤的复发、转移，并且无其他抗癌药物常见的毒副作用，完全可以长期使用。Rg3在较大计量时还能抑制肿瘤瘤细胞的增殖、浸润，诱导肿瘤细胞凋亡。然而自然生长的人参中人参皂苷Rg3含量极少，可以通过化学法、酶法和微生物法达到转化的目的。微生物法转化原理主要在于微生物所分泌的J3-葡萄糖苷酶为主的酶系对人参皂苷进行转化。邵巍等在《GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件》中报道，利用β-葡萄糖苷酶将人参皂苷Rbl的C-21位两个-GLc键水解，进而转化为稀有人参皂苷Rg3;闫炳雄等在《黑曲霉固体发酵三七药材的皂苷变化研究》中，发现经黑曲霉发酵人参后，也可生成人参皂苷Rg3，并得到较好的转化效果。[0003]开菲尔粒KefirGrain是开菲尔的菌种，Kefir粒是一种多菌种共生的可食用微生物资源，常用来发酵牛乳、羊乳等制成酸乳制品，与普通酸乳制品相比，开菲尔乳最大的特点是，发酵过程中会产生二氧化碳，使得该制品有碳酸饮料的独特口感，所以该产品又被称为牛奶酒或酸乳酒。有研究表明Kefir粒发酵液中含有β-葡萄糖苷酶在内的丰富酶系，其中J3-葡萄糖苷酶是转化人参皂苷的重要酶之一，但目前利用Kefir粒发酵人参的研究鲜有报道。发明内容[0004]本发明的目的是为了解决人参口味不佳的问题，而提供一种口味好、人参皂苷Rg3含量高、食用安全的Kefir粒人参发酵液及马克斯克鲁维酵母人参发酵液。[0005]Kefir粒人参发酵液，它是由下述方法制备的：按重量百分比，将3_6%kefir粒接种到人参浆中，26-30°C条件下发酵60-84h;所述的发酵时间72h;所述的人参浆为将人参蒸制15-25min，加水打浆，高温灭菌。[0006]马克斯克鲁维酵母人参发酵液，它是由下述方法制备的：按重量百分比，将2-6%马克斯克鲁维酵母接种到人参浆中，26-30°C条件下发酵36-72h；所述的重量百分比为3%;所述的发酵时间为48h;所述的人参浆为将人参蒸制15-25min，加水打浆，高温灭菌；所述的马克斯克鲁维酵母它的保藏编号为CGMCC13907。[0007]本发明提供了一种Kefir粒人参发酵液及马克斯克鲁维酵母人参发酵液。Kefir粒人参发酵液，是按重量百分比将kefir粒接种到人参浆中发酵，发酵后稀有皂苷Rg3提高了134.7%，人参皂苷Rd提高了104.5%;马克斯克鲁维酵母人参发酵液，是按重量百分比将马克斯克鲁维酵母接种到人参浆中发酵，发酵后人参皂苷Rg3含量为3.31mgg;本发明利用Kefir粒发酵人参，食用安全，同时改善了人参口感，提高了稀有皂苷的含量，使人参药用价值更高、肠道吸收功能性强。马克斯克鲁维酵母发酵人参后产生特殊的香气，给人们一种非常愉悦的感受;对kefir粒发酵人参后香气成分进行分析，发现发酵后的人参增加了果香味和烧烤香味，同时降低其不良风味。附图说明[0008]图1产J3-葡萄糖苷酶菌菌株的培养形状与形态特征;A.c21菌株在改良七叶苷培养基中的形态;B.c21菌株在种子培养基中的形态;C.c21菌株在显微镜（X100下的形态；图2待测菌株C2126SrDNAD1D2区域的PCR;图3依据26SrDNA序列的系统发育树；图4参水比、接种量、发酵时间对人参皂苷Rg3影响。具体实施方式[0009]实施例IKefir粒发酵人参浆挑选无病虫害的完整鲜人参，清洗干净，蒸制20min，按照参水质量比（gg1:2、5000rpmmin多次点动共计3min打楽，110°C灭菌20min。按kefir粒5%ww的接种量接种到人参浆中，28°C条件下培养3d;同等培养条件下加入相等体积的无菌水，作为未发酵人参空白对照组。发酵结束后立即冷冻，随后使用真空冷冻进行干燥，干燥后样品真空包装，在_4°C下储存备用。HPLC法与TLC法相结合分析人参浆中人参皂苷Rg3的转化情况。[0010]所述的HPLC法分析条件:C18色谱柱4.6mmX250mm，5μπι;柱温35°C;进样量10yL;流速ImLmirT1;流动相A为含5%磷酸的水溶液、B为乙腈，洗脱条件是0〜45min，33%B，45〜80min，49%B;检测波长为203nm。[0011]所述的TLC法，是将人参皂苷点样于薄层层析硅胶板上，展开剂为氯仿-甲醇-水10:5:1VVV，喷20%硫酸-乙醇溶液后于110°C显色5min。用薄层扫描仪扫描其灰度，计算皂苷转化率。[0012]人参皂苷Rg3有多种转化途径，其中一条转化途径为人参皂苷Rbl—Rd—Rg3。本实验测定发酵人参浆中人参皂苷Rbl、Rd和Rg3的变化，结果如表1所示。很显然，kefir粒发酵后大大增加了Rg3的含量，稀有皂苷Rg3提高了134.7%;同时，发酵人参中人参皂苷Rbl比未发酵组降低了41.3%，人参皂苷Rd提高了104.5%。因此可以推测，kefir粒发酵人参转化人参皂苷Rg3可能的转化途径为Rbl4Rd—Rg3,表明β-葡萄糖苷酶在该转化途径中起重要作用。注:表中所有数据均为平均值土标准偏差n=3，涉及到人参皂苷含量均为占人参干[0013]重。[0014]实施例2产β-葡萄糖苷酶的菌株的筛选kefir粒在28°C下发酵人参浆48h后，将其按10—3、10—4、10—5、10—6四个梯度稀释，各取50yL菌液均匀涂布于改良七叶苷培养基，25°C培养48h，菌落周围出现黑色的水解斑则为产J3-葡萄糖苷酶菌株。Kefir粒发酵人参菌液涂布于改良七叶苷培养基上培养36h后，筛选出产黑色水解斑的菌株C21图1A，判断其为产β-葡萄糖苷酶菌菌种。将该菌株接入固体种子培养基后观察发现菌落呈乳白色、平滑、不透明，表面光滑，菌落易挑起（图1B。显微镜（X100下观察形态结果如图IC所示，初步鉴定结果为一株产酵母菌。[0015]所述的改良七叶苷琼脂糖培养基，为Ig七叶苷、0.5g柠檬酸铁、2g酵母膏、0.5g蛋白胨、20g琼脂，经121°C高压蒸汽灭菌20min;种子培养基配方为10g酵母粉、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂、1000mL蒸馏水、调至pH6.0、经121°C高压蒸汽灭菌20min。[0016]实施例3产β-葡萄糖苷酶的菌株的分子鉴定分子鉴定方法:26SrDNAD1D2区的序列分析。待测菌株DNA提取采用SK8257试剂盒操作；使用引物为NLl5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL45’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’），由上海生工股份有限公司合成引物和序列测定，所得菌株DNA序列信息在从^1上酊38计|：对分析。？〇?反应体系（25以10，包括基因组0嫩20-501^^0.5以1^10\Buffer含有Mg2+2.5yL，dNTP各2.5mMlyL，酶0.2yL、F10μΜ0·5yL，R10μΜ0·5yL，加双蒸水至25yL;PCR反应程序为94°C预变性4min、94°C延伸45s30个循环;55°C延伸45s30个循环;72°C延伸Imin30个循环;72°C修复延伸Imin;4°C终止反应。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为150V、100mA，20min，使用凝胶成像仪观察结果。[0017]利用NLl和NL4—对引物扩增待测菌株26SrDNA近5’端D1D2区域，扩增结果见图2。由图2可知，扩增产物经电泳检测出现578bp荧光条带，与预期结果一致，片段大小与已报道的片段500〜600bp相符。将待测菌株的D1D2区域测序，在GenBank中进行同源性序列搜索BLASTSearch，结果显示待测菌株与马克斯克鲁维酵母序列相比，同源性高达99%图3，因此进一步验证待测菌株为马克斯克鲁维酵母XuyveroffiycesmrxiaMs。该菌种是克鲁维酵母属中非常重要的一个菌种，因其耐高温、生长速率快且安全性高等诸多优势而应用于如酶类、乙醇等工业生物技术领域。微生物转化人参皂苷反应机制一般认为是微生物产生的酶水解人参皂苷中的糖基，从而引起结构的改变而得到稀有皂苷，如人参皂苷Rg3。目前研究结果表明，微生物转化Rg3的酶主要为β-葡萄糖苷酶，而利用微生物产β-葡萄糖苷酶应用于人参皂苷转化的研究多数为黑曲霉等真菌。因黑曲霉菌株的产酶活性会随着保存时间的增长而降低，不利于储存，在食品加工中的应用受到限制。kefir粒中含有多种乳酸菌和酵母菌等微生物，但是kefir粒发酵全组分人参时，发现产β-葡萄糖苷酶的微生物为马克斯克鲁维酵母。马克斯克鲁维酵母适应性强，可以推测kefir粒发酵人参中马克斯克鲁维酵母成为了优势菌种，抑制了乳酸菌的生长。将该菌株分类名称:Kluyveromycesmarxianus保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC13907,北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏于2017年3月21日。[0018]实施例4全组分发酵人参浆中总人参皂苷的提取将分离得到的马克斯克鲁维酵母菌株C21以5%WW添加量接种到全人参培养基中，28°C条件下静止培养48h。同等培养条件下加入相等体积的无菌水作为未发酵人参空白对照组。发酵结束后立即冷冻，随后使用真空冷冻进行干燥，干燥后样品真空包装，在-4°C下储存备用。[0019]取发酵人参浆冻干粉末Ig，利用索氏提取法，三氯甲烷加热回流3h后，弃去三氯甲烷，挥干溶剂，移入100mL锥形瓶中，加入50mL水饱和正丁醇，静置过夜后，超声处理功率250W，频率50Hz30min，过滤后取滤液25mL，置于蒸发皿中蒸干，干燥物中加入少量甲醇溶液完全溶解后转入5mL容量瓶定容后用于检测。将各人参皂苷标品溶于100%甲醇中制得0.2mgmL溶液用于阜苷分析。[0020]实施例5马克斯克鲁维酵母菌发酵人参提高人参皂苷Rg3工艺优化考察参水比、接种量、发酵时间对转化人参皂苷Rg3含量mgg的影响。人参皂苷Rg3含量mgg表示稀有人参阜苷Rg3含量占人参干重质量比。以转化人参阜苷Rg3含量mgg为考核指标，确定各单因素合适的发酵条件，为转化人参皂苷Rg3的条件优化提供参考范围，试验设计的每个因素设置3个平行。筛选得到的菌株转化人参Rg3单因素试验的基础上，采用中心组合试验Box-Behnken设计试验因素与水平（见表2，试验结果用DesignExpert8.1分析，确定各因素及因素之间的交互作用对人参皂苷Rg3含量的影响，优化其工艺条件。[0021]从影响发酵效果最重要的几个因素，参水比、发酵时间和接种量出发，研究了转化人参皂苷Rg3的效果见图4。结果显示，参水比在1:2-1:2.6范围内，随着比例的增加，人参皂苷Rg3含量呈现上升趋势，当参水比为1:2.6时人参皂苷含量达到最大值为3.22±0.18mgg，随后人参皂苷Rg3含量有所下降，但是仍高于初始状态，可能在人参浆量固定的状态下，参水比越高人参的含量相对减少，微生物发酵底物减少，进而导致人参皂苷含量下降。考察马克斯克鲁维酵母接种量对稀有皂苷转化率的影响中发现，随着接种量的增加，人参皂苷Rg3的含量呈现先增加后减少的趋势，当接种量为3%时人参皂苷含量达到最高值3.02±0.25mgg，随后人参皂苷Rg3的含量有所下降，这可能是由于酵母菌的积累，所产生的次级代谢产物将人参皂苷Rg3转化成其他皂苷。在发酵时间1-9天内，随着发酵时间增加，人参皂苷Rg3含量呈现先上升后下降的趋势，且呈阶梯状下降，当发酵时间为3天时，人参皂苷Rg3的含量达到最大值3.13±0.11mgg，之所以会呈现这种变化趋势，可能是由于发酵时间过长，水分含量逐渐减少，导致活菌数减少，又因营养物质减少，次级代谢产物积累，影响人参皂苷Rg3的积累。[0022]根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，进行3因素3水平响应面试验，结果如表3所示。对数据进行方差分析，结果表明实验所采用二次回归方程模型高度显著，在统计学上是有意义的。对比影响人参皂苷Rg3含量的因素为参水比A酵母接种量B发酵时间（C。通过数据的处理分析，求得响应面R的最大预测值为3.3298mgg，此时的参水比为1:2.65、发酵时间3d、马克斯克鲁维酵母接种量2.94%。为检验模型的准确性，采用优化后最佳发酵条件下进行发酵试验，三次试验得到人参皂苷Rg3含量平均值为3.31±0.04mgg。预测值与实际值接近，说明该优化的发酵工艺是有效的。[0023]注:人参阜苷Rg3含量mgg表示，占人参干重质量比。[0024]本发明用kefir粒以及从kefir粒分离得到的马克思克鲁维酵母菌株C21发酵全组分人参，发现均能显著提高人参皂苷Rg3含量，经优化发酵工艺后人参皂苷Rg3含量与未发酵人参中人参皂苷Rg3相比提高了3.48倍。马克斯克鲁维酵母发酵人参后产生特殊的香气，给人们一种非常愉悦的感受;对kefir粒发酵人参后香气成分进行分析，发现发酵后的人参增加了果香味和烧烤香味，同时降低其不良风味。

权利要求：1.Kefir粒人参发酵液，它是由下述方法制备的：按重量百分比，将3_6%kefir粒接种到人参浆中，26-30°C条件下发酵60-84h。2.根据权利要求1所述的Kefir粒人参发酵液，其特征在于:所述的发酵时间72h。3.根据权利要求1或2所述的Kefir粒人参发酵液，其特征在于:所述的人参浆为将人参蒸制15-25min，加水打楽，高温灭菌。4.马克斯克鲁维酵母人参发酵液，它是由下述方法制备的：按重量百分比，将2-6%马克斯克鲁维酵母接种到人参浆中，26-30°C条件下发酵36-72h〇5.根据权利要求4所述的马克斯克鲁维酵母人参发酵液，其特征在于:所述的重量百分比为3%。6.根据权利要求5所述的马克斯克鲁维酵母人参发酵液，其特征在于:所述的发酵时间为48h。7.根据权利要求6所述的马克斯克鲁维酵母人参发酵液，其特征在于:所述的人参浆为将人参蒸制15-25min，加水打楽：，高温灭菌。8.根据权利要求7所述的马克斯克鲁维酵母人参发酵液，其特征在于:所述的马克斯克鲁维酵母，它的保藏编号为CGMCC13907。

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