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申请/专利权人:吉林大学
摘要:一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法,属于生物技术领域。本发明的目的是利用Crisprcas9技术敲除GADD45a基因,构建兔模型,探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法。本发明的步骤是:构建sgRNA、合成双链DNA、p UC‑57载体线性化、连接p UC‑57载体和双链DNA、转化、单克隆的挑取及质粒DNA的提取、鉴定质粒测序、CAS9表达质粒,经酶切线性化,用于体外转录。本发明经过相关检测,成功获得Gadd45a敲除兔模型,该模型的获得能够在给予相应酒精刺激后模拟临床上脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝功能病的病理过程,能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果,同时大大降低新药研发的风险,为临床研究提供基础模型。
主权项:一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法,其特征在于:①构建sgRNA:在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个sgRNA序列作用靶点,合成两对寡聚核苷酸链:Sgrna1‑F TAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrna1‑RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2‑F TAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2‑R AAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT;②合成双链DNA:两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA;反应条件:95℃ 5min后室温放置1h;双链DNA反应体系;③p UC‑57载体线性化:p UC‑57载体在与②中合成的DNA连接时,需要先经Bbs I线性化,并回收纯化;酶切反应体系表;④连接p UC‑57载体和双链DNA:按如下连接体系进行混样,简短离心,放入16℃连接仪连接过夜,连接反应体系表;⑤转化:(1)从‑80℃冰箱取50 μL感受态细菌,加入10 μL④中的连接产物,混匀,在冰上冷却30分钟;(2)42℃水浴热激90s,冰上冷却2分钟;(3)加200μL LB液体培养基,在恒温震荡培养箱37℃,250 rpm震荡培养30 min;(4)吸取200 μL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上,放于37℃恒温培养箱中培养12小时;⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取:从培养基中挑取单菌落,接种于6 mL液体LB培养基中,培养基中含6 μL氨苄青霉素,放于摇床中,37℃培养12‑14h;将细菌中的质粒提取出来;⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析,测序连接正确后可用于后续实验;⑧CAS9表达质粒,经酶切线性化,用于体外转录;CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成,酶切37℃ 3h,电泳跑胶后,使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收;酶切体系。
全文数据:采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域。背景技术[0002]Gadd45家族是DNA损伤修复的重要相关基因,在细胞凋亡中发挥重要的作用。该家族由三个基因Gadd45a、Gadd45b和Gadd45g组成,调节各种细胞命运和功能,包括调控细胞周期、细胞凋亡、DNA修复和表观遗传修饰等。Gadd45a作为该家族基因之一目前的研究还主要在细胞水平上,对于动物体的影响还不明确。有文献表明在肝硬化和肝细胞癌HCC组织中Gadd45a的表达量下调。因此,我们猜测Gadd45a对肝脏功能可能有一定的影响。故建立Gadd45a敲除兔模型,对其酒精灌胃处理,观察肝损伤程度。[0003]人类肝病的病症模型肝病机理研究和新药研发的重要基础。因此建立敲除兔模型,刺激其产生相应的肝损伤,有效地模拟人类肝病的病理过程,能更有效地预测新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果,同时大大降低新药研发的风险。发明内容[0004]本发明的目的是利用CrisprCas9技术敲除GADD45a基因,构建兔模型,探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法。[0005]本发明的步骤是:①构建sgRNA:在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个SgRNA序列作用祀点,合成两对寡聚核苷酸链:SgrnaI-FTAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrnaI-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2-FTAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2-RAAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT;②合成双链DNA:两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA;反应条件:95°C5min后室温放置Ih;双链DNA反应体系③pUC-57载体线性化:pUC-57载体在与②中合成的DNA连接时,需要先经BbsI线性化,并回收纯化;酶切反应体系表④连接PUC-57载体和双链DNA:按如下连接体系进行混样,简短离心,放入16°C连接仪连接过夜,连接反应体系表⑤转化:1从-80°c冰箱取50yL感受态细菌,加入10yL④中的连接产物,混匀,在冰上冷却30分钟;242°C水浴热激90s,冰上冷却2分钟;3加200yLLB液体培养基,在恒温震荡培养箱37°C,250rpm震荡培养30min;4吸取200yL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上,放于37°C恒温培养箱中培养12小时;⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取:从培养基中挑取单菌落,接种于6mL液体LB培养基中,培养基中含6yL氨苄青霉素,放于摇床中,37°C培养12-14h;将细菌中的质粒提取出来;⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析,测序连接正确后可用于后续实验;⑧CAS9表达质粒,经酶切线性化,用于体外转录;CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成,酶切37°C3h,电泳跑胶后,使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收;酶切体系[0006]本发明模型建立过程:1受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素FSH,之后注射人绒毛膜促性腺激素HCG购于宁波第二激素厂),获取受精卵,通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNAsgRNA混合物注射到细胞质中CAS9mRNA150ngAU;sgRNA30ngAU。[0007]2体外培养受精卵并进行发育将显微注射的受精卵转移到培养液中,置于37°C恒温培养箱中培养,发育到桑椹胚时期时,用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中,用于后面实验;3胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定显微注射后的胚胎,体外培养5d后,取出发育至桑椹胚期的胚胎,放于PBS中清洗3次后,收集单个胚胎至于PCR管中,在单个胚胎中加入5yLNP40裂解液进行胚胎裂解,裂解条件为:56°C,Ih;95°C,10min,以裂解产物为模板,使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增,电泳鉴定,并进行DNA测序,得到基因型鉴定结果;设计PCR引物如下:上游引物:GGGTTCGGATTGCCCAAASense下游引物:GGTGCCCTGTGCAAACTAntiSensePCR反应体系PCR反应条件:95°C预变性5min;94°C变性30s,58°C退火30s,72°C延伸40s;35个循环;72°C延伸5min;4注射后的受精卵移植及动物培育显微注射后,将受精卵移植,进行胚胎发育,进行规范化饲养。[0008]本发明经过相关检测,成功获得Gadd45a敲除兔模型,该模型的获得能够在给予相应酒精刺激后模拟临床上脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝功能病的病理过程,能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果,同时大大降低新药研发的风险,为临床研究提供基础模型。附图说明[0009]图1是本发明表达载体HJC57-sgRNA的结构示意图;图2是本发明PCR产物鉴定胚胎Gadd45a基因敲除情况的电泳图;图3是测序结果。具体实施方式[0010]本发明步骤是:pUC57-sgRNA载体构建①构建sgRNA:在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个SgRNA序列作用祀点,合成两对寡聚核苷酸链:SgrnaI-FTAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrnaI-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2-FTAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2-RAAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT;②合成双链DNA:两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA;反应条件:95°C5min后室温放置Ih;双链DNA反应体系③pUC-57载体线性化:pUC-57载体在与②中合成的DNA连接时,需要先经BbsI线性化,并回收纯化;酶切反应体系表④连接PUC-57载体和双链DNA:按如下连接体系进行混样,简短离心,放入16°C连接仪连接过夜,连接反应体系表⑤转化:1从-80°c冰箱取50yL感受态细菌,加入10yL④中的连接产物,混匀,在冰上冷却30分钟;242°C水浴热激90s,冰上冷却2分钟;3加200yLLB液体培养基,在恒温震荡培养箱37°C,250rpm震荡培养30min;4吸取200yL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上,放于37°C恒温培养箱中培养12小时;⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取:从培养基中挑取单菌落,接种于6mL液体LB培养基中,培养基中含6yL氨苄青霉素,放于摇床中,37°C培养12-14h;将细菌中的质粒提取出来;⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析,测序连接正确后可用于后续实验;⑧CAS9表达质粒,经酶切线性化,用于体外转录;CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成,酶切37°C3h,电泳跑胶后,使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收;酶切体系[0011]本发明模型建立过程:1受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素FSH,之后注射人绒毛膜促性腺激素HCG购于宁波第二激素厂),获取受精卵,通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNAsgRNA混合物注射到细胞质中CAS9mRNA150ngAU;sgRNA30ngAU。[0012]2体外培养受精卵并进行发育将显微注射的受精卵转移到培养液中,置于37°C恒温培养箱中培养,发育到桑椹胚时期时,用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中,用于后面实验;3胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定显微注射后的胚胎,体外培养5d后,取出发育至桑椹胚期的胚胎,放于PBS中清洗3次后,收集单个胚胎至于PCR管中,在单个胚胎中加入5yLNP40裂解液进行胚胎裂解,裂解条件为:56°C,Ih;95°C,10min,以裂解产物为模板,使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增,电泳鉴定,并进行DNA测序,得到基因型鉴定结果;设计PCR引物如下:上游引物:GGGTTCGGATTGCCCAAASense下游引物:GGTGCCCTGTGCAAACTAntiSensePCR反应体系PCR反应条件:95°C预变性5min;94°C变性30s,58°C退火30s,72°C延伸40s;35个循环;72°C延伸5min;4注射后的受精卵移植及动物培育显微注射后,将受精卵移植,进行胚胎发育,进行规范化饲养。
权利要求:I.一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法,其特征在于:①构建sgRNA:在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个SgRNA序列作用祀点,合成两对寡聚核苷酸链:Sgrnal-FTAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrnal-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2-FTAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2-RAAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT;②合成双链DNA:两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA;反应条件:95°C5min后室温放置Ih;双链DNA反应体系③pUC-57载体线性化:pUC-57载体在与②中合成的DNA连接时,需要先经BbsI线性化,并回收纯化;酶切反应体系表④连接PUC-57载体和双链DNA:按如下连接体系进行混样,简短离心,放入16°C连接仪连接过夜,连接反应体系表⑤转化:1从-80°C冰箱取50yL感受态细菌,加入10yL④中的连接产物,混匀,在冰上冷却30分钟;242°C水浴热激90s,冰上冷却2分钟;3加200yLLB液体培养基,在恒温震荡培养箱37°C,250rpm震荡培养30min;4吸取200yL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上,放于37°C恒温培养箱中培养12小时;⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取:从培养基中挑取单菌落,接种于6mL液体LB培养基中,培养基中含6yL氨苄青霉素,放于摇床中,37°C培养12-14h;将细菌中的质粒提取出来;⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析,测序连接正确后可用于后续实验;⑧CAS9表达质粒,经酶切线性化,用于体外转录;CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成,酶切37°C3h,电泳跑胶后,使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收;酶切体系2.权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法,其特征在于:pUC57-sgRNA载体序列为SEQIDNo.1权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法,其特征在于:模型建立过程:1受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素,之后注射人绒毛膜促性腺激素,获取受精卵,通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNAsgRNA混合物注射到细胞质中,其中CAS9mRNA150ngAU;sgRNA30ngμΐ;2体外培养受精卵并进行发育将显微注射的受精卵转移到培养液中,置于37°C恒温培养箱中培养,发育到桑椹胚时期时,用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中,用于后面实验;3胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定显微注射后的胚胎,体外培养5d后,取出发育至桑椹胚期的胚胎,放于PBS中清洗3次后,收集单个胚胎至于PCR管中,在单个胚胎中加入5yLNP40裂解液进行胚胎裂解,裂解条件为:56°C,Ih;95°C,10min,以裂解产物为模板,使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增,电泳鉴定,并进行DNA测序,得到基因型鉴定结果;设计PCR引物如下:上游引物:GGGTTCGGATTGCCCAAASense下游引物:GGTGCCCTGTGCAAACTAntiSensePCR反应体系PCR反应条件:95°:预变性51^11;94°:变性3〇8,58°:退火3〇8,72°:延伸4〇8;35个循环;72°:延伸5min;4注射后的受精卵移植及动物培育显微注射后,将受精卵移植,进行胚胎发育,进行规范化饲养。
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