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申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明公开了一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，包括以下步骤：根据pEGFP‑N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP‑N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15‑25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；将扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP‑N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP‑GADD45a的重组质粒；其能用于研究示踪猪GADD45a在不同细胞中的定位。本发明开拓了目前研究猪GADD45a功能及其定位方面研究的新思路。

主权项：1.一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：1、根据pEGFP‑N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP‑N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15‑25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；2、GADD45a荧光示踪表达载体的构建：将利用含有载体末端15‑25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP‑N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP‑GADD45a的重组质粒。

全文数据：示踪猪GADD45a亚细胞定位的方法及用途技术领域本发明涉及一种示踪猪GADD45agrowtharrestandDNAdamageinduciblealpha亚细胞定位的方法建立及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。背景技术GADD45a又叫DDIT1是生长阻滞和DNA损伤诱导基因家族成员之一，参与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老和肿瘤发生发展等。在多种因素诱导的细胞应激及DNA损伤应答调控网络中发挥重要生物学功能，抑制细胞增殖、促进凋亡；还可以通过阻滞细胞周期、修复DNA损伤和促进细胞凋亡等途径减少细胞癌变的可能和肿瘤的发生。p53基因是一个广谱抑癌基因，参与细胞周期、细胞生长、细胞凋亡、DNA损伤和修复的调控，在基因调控网络中具有中枢地位。GADD45a是第一个被检出的p53的下游基因，是一个能够识别基因组损伤的重要生物标志物。也是BRCA1的下游基因。GADD45a可由UV放射、低氧、离子辐射、基因毒性药物等损伤因素快速诱导产生，可以通过p53依赖及非依赖两条途径被诱导表达增高，在调控细胞周期、维持基因组稳定性、细胞凋亡、DNA损伤修复以及信号传导等重要细胞生命活动中起重要作用。猪GADD45a基因的mRNA序列有1527bp，一共4个外显子，编码序列全长为498bp，编码165个氨基酸，编码约18kD的蛋白。但是，目前关于猪GADD45a的研究报道甚少，未见关于猪GADD45a亚细胞定位的相关研究。最近研究也发现，GADD45A可以调控脂肪细胞分化聚酯。在猪上，GADD45a可能与肌内脂肪沉积密切相关。因此，开展GADD45a亚细胞定位及其在糖脂代谢中的功能研究具有重要的意义。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种猪GADD45a亚细胞地位的研究方法建立，以及该方法的用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪GADD45a荧光示踪表达载体pEGFP-GADD45a，即，带EGFP荧光报告基团的GADD45a表达载体的构建方法，包括以下步骤：1、根据pEGFP-N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列靶序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP-N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因GADD45a基因的引物Ⅱ；注：设计上述目的基因的下游引物时必须使目的基因与GFP在同一阅读框；2、GADD45a荧光示踪表达载体pEGFP-GADD45a的构建：将利用含有载体末端15-25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP-N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选卡那霉素平板、鉴定PCR鉴定满足扩增条带大小约500bp；测序鉴定满足序列与猪GADD45a序列一致后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。即：全长序列克隆和同源重组：扩增出两端含同源臂的PCR产物，切胶回收。使用TreliefTMSoSooCloningKitVer.2试剂盒进行同源重组，构建pEGFP-GADD45a的重组质粒，转化大肠杆菌，并挑选单克隆测序验证。使用内切酶XhoI酶切载体pEGFP-N1，胶回收线性化载体。将扩增出两端含同源臂的PCR产物，切胶回收。将XhoI线性化载体和含同源臂的PCR产物同源重组，并转化大肠杆菌，抗性卡那霉素筛选，以线性化载体作空白对照。作为本发明的猪GADD45a荧光示踪表达载体pEGFP-GADD45a的构建方法的改进：引物Ⅰ扩增GADD45a全长的引物为：GADD45a-F：ATGACTTTGGAGGAATTCTCGGCGADD45a-R：TCACCGTTCAGGAAGATTAATCACTG引物Ⅱ含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因引物为：XhoI-GADD45a-F：ctaccggactcagatctcgagccaccATGACTTTGGAGGAATTCTCGGXhoI-GADD45a-R：aattcgaagcttgagctcgagCCGTTCAGGAAGATTAATCACTGG。同源臂示意图如图3所述。作为本发明的猪GADD45a荧光示踪表达载体pEGFP-GADD45a的构建方法的进一步改进：所述步骤2为：将pEGFP-N1质粒进行XhoI酶切线性化后，使用TreliefTMSoSooCloningKitVer.2试剂盒与含有同源臂的GADD45a基因引物PCR扩增产物进行同源重组，并采用热激转化大肠杆菌，得到pEGFP-GADD45a的重组质粒。作为本发明的猪GADD45a荧光示踪表达载体pEGFP-GADD45a的构建方法的进一步改进，步骤2所得的表达载体进行鉴定：通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为GADD45a全长引物；测序引物为CMV-F和PEGFP-N3引物，分别为5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’和5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’。即，本发明先将单克隆菌进行鉴定，挑取单克隆菌使用全长引物进行PCR验证，验证后进一步使用CMV-F与PEGFP-N3测序鉴定。本发明还同时提供了上述猪GADD45a荧光示踪表达载体pEGFP-GADD45a的用途：用于研究示踪猪GADD45a在不同细胞中的定位。作为本发明用途的改进：用于研究猪GADD45a在不同细胞种类中的亚细胞定位及其功能。具体而言：构建好的pEGFP-GADD45a转染到293T、IPEC-J2、猪脂肪细胞等不同的细胞后，通过免疫荧光检测技术可以较好的示踪猪GADD45a在不同细胞中的亚细胞定位。因此，可以用于研究GADD45a在不同细胞中的亚细胞定位、功能及相关调控研究。即，提取阳性克隆的质粒pEGFP-GADD45a，转染不同293T、IPEC-J2和猪脂肪前体细胞，荧光显微镜观察GADD45a亚细胞定位。作为本发明用途的进一步改进：包括以下步骤：1、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；2、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞、IPEC-J2等细胞，37℃，5％的CO2中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；3、转染48h后，分析GADD45a表达情况及其亚细胞定位，研究其亚细胞定位和功能调控等。本发明的示踪猪GADD45a亚细胞地位的方法建立及其用途，具有以下有益效果：本发明根据pEGFP-N1载体载体信息和靶序列设计并合成了含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因扩增引物，割胶回收的到的扩增产物和线性化的pEGFP-N1载体同源重组后，转化大肠杆菌DH5α，经筛选和鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。构建好的pEGFP-GADD45a可以较好的示踪猪GADD45a在不同细胞中的亚细胞定位。本发明是利用荧光报告基团标记技术示踪GADD45a的细胞定位，开拓了目前研究猪GADD45a功能及其定位方面研究的新思路。此法所得的pEGFP-GADD45a，构建方法简单、可行，具有较好的示踪效果，是研究猪GADD45a功能及其定位的一种强有力的研究技术，为较好的研究GADD45a在猪发育生长和营养吸收代谢过程中的功能研究具有重要的意义。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1是扩增目的基因的电泳检测图；图中：M---Marker，1---56℃退火条件下扩增结果，2---59℃退火条件下扩增结果；图2是内切酶XhoI酶切载体pEGFP-N1后的电泳检测图；图中：M---DNAmarker，1---酶切质粒，2---原质粒；图3是同源臂示意图；图4是利用含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因引物扩增的PCR产物检电泳捡测图；图中：M---DNAmarker；1---PCR产物电泳结果；图5是同源重组后单克隆菌形成结果；图中：1---转化重组子pEGFP-GADD45a的板；2---转化线性化pEGFP-N1的空白对照板；图6是重组单克隆菌PCR检测电泳结果；图中：M---DNAmarker；1～8---阳性克隆PCR产物电泳结果；图7是pEGFP-GADD45a测序及BLAST结果；图8是pEGFP-GADD45a转染293T细胞后Westernblot检测结果；图中：Con---空白对照；OE---pEGFP-GADD45a；图9是用pEGFP-GADD45a示踪猪GADD45a在293T细胞中的亚细胞定位检测结果；图10是pEGFP-GADD45a转染猪IPEC-J2细胞后Westernblot检测结果；图中：Con---空白对照；N1---pEGFP-N1；OE---pEGFP-GADD45a；图11是用pEGFP-GADD45a示踪猪GADD45a在IPEC-J2细胞中的亚细胞定位检测结果；图12是pEGFP-GADD45a转染猪脂肪细胞后Westernblot检测结果；图13是用pEGFP-GADD45a示踪猪GADD45a在猪脂肪细胞中的亚细胞定位检测结果。注：图9、图11、图13中的“DAPI”为用DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole染色后的细胞核，“Merge”为GADD45a和DAPI整合后图像。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：一、含荧光报告基团的pEGFP-GADD45a表达载体的构建与鉴定1、猪GADD45a全长基因扩增：根据猪GADD45a全长基因序列，设计扩增猪GADD45a全长序列的扩增引物，序列为：GADD45a-F：ATGACTTTGGAGGAATTCTCGGCGADD45a-R：TCACCGTTCAGGAAGATTAATCACTGPCR反应体系为：PCR反应条件为：194℃预变性5min；294℃变性30sec，56℃或59℃45sec，72℃55sec，共35个循环；372℃5min，4℃保存。扩增产物电泳结果见图1。根据图1可得知：成功扩增得到500bp左右的猪GADD45a全长基因片段，将用于步骤3的PCR反应中的cDNA模板。2、pEGFP-N1载体线性化：使用内切酶XhoI酶切载体pEGFP-N1，酶切反应体系如下：37℃水浴锅中进行酶切反应3h，酶切产物电泳检测结果如图2。根据图2，可得知：载体pEGFP-N1酶切成功，然后通过胶回收线性化载体。3、扩增带载体同源臂的目的基因：根据pEGFP-N1载体信息，按照XhoI酶切位点设计含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因引物，设计该目的基因的下游引物时必须使目的基因与GFP在同一阅读框图3。引物序列为：XhoI-GADD45a-F：ctaccggactcagatctcgagccaccATGACTTTGGAGGAATTCTCGGXhoI-GADD45a-R：aattcgaagcttgagctcgagCCGTTCAGGAAGATTAATCACTGG。以步骤1PCR扩增得到的500bp左右的扩增产物为cDNA模板，通过PCR反应，扩增出两端含同源臂的PCR产物，PCR反应体系为：PCR反应条件为：194℃预变性5min；294℃变性30sec，59℃45sec，72℃55sec，共35个循环；372℃5min，4℃保存。PCR结束后，PCR扩增产物进行电泳检测图4，正确的条带即，满足条带大小约550bp的条带进行切胶回收。4、同源重组：使用TreliefTMSoSooCloningKitVer.2试剂盒进行同源重组，反应体系如下：同源重组反应条件为：50℃反应5min。5、转化感受态：取全部同源重组反应液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含卡那霉素抗性筛选的平板卡那霉素浓度为100μgml，以LB培养基作为平板上，37℃培养过夜；以线性化载体作阴性对照图5。6、阳性克隆鉴定：经卡那霉素抗性初步筛选后，挑取白色单菌落接种于3ml液体LB培养基中含卡那霉素100ngml，37℃振荡培养12h，得菌液；以基因全长扩增引物GADD45a-F、GADD45a-R进行PCR鉴定。PCR体系同步骤1，其中猪脂肪组织cDNA模板以菌液代替。PCR反应条件为：194℃预变性5min；294℃变性45sec，59℃45sec，72℃55sec，共35个循环；372℃7min，4℃保存。上述阳性克隆菌液PCR鉴定结果表明，PCR扩增的片段大小与本实验预期结果相符，确定为阳性克隆图6。对阳性克隆利用CMV-F与PEGFP-N3引物进行测序检测鉴定。CMV-F引物为5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；PEGFP-N3引物为5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’。阳性克隆正反向测序及序列比对鉴定结果表明，插入的序列为猪GADD45a序列图7，证明pEGFP-GADD45a表达质粒构建成功。从而成功得到pEGFP-GADD45a的表达载体重组质粒。这为进一步研究GADD45a基因的亚细胞定位及功能奠定了基础。具体而言：图7中，从上至下分别为：GADD45a-EGFP-N1-3菌液和ADD45a-EGFP-N1-4菌液的CMV-F和PEGFP-N3测序及比对结果。二猪GADD45a在293T细胞中的表达及亚细胞定位研究1、pEGFP-GADD45a转染：将第一步构建筛选得到的含猪pEGFP-GADD45a表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；利用LipofectamineTM2000介导将pEGFP-GADD45a质粒转染293T细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为70％～90％，生长培养基为DMEM+10％胎牛血清不含抗生素；对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基稀释3μgDNA；对于每孔细胞，使用50μlOPTI-MEMⅠ培养基稀释10μlLipofectamineTM2000试剂。LipofectamineTM2000稀释后，在30min内同稀释的DNA混合保温时间过长会降低活性，“10μlLipofectamineTM2000试剂+50μlOPTI-MEMⅠ培养基”稀释后所得的全部与“3μgDNA+50μl无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基”稀释后所得的全部进行混合，在室温保温20min复合物可以在室温保持6h稳定；直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀，每处理重复三次。如果在无血清条件下转染，使用正常生长培养基进行细胞铺板，在加入复合物前移去生长培养基，替换无血清培养基；在37℃，5％的CO2中保温4～6h后更换生长培养基；在转染48h后，Westernblot和荧光显微镜观察效果。2、效果检测：转染48h后，提取细胞中总蛋白，采用Westernblot方法检测GADD45a和GFP的蛋白表达水平。同时，进行DAPI染色，荧光显微镜下观察绿色荧光信号，并拍照。结果为：与空白对照组相比，转染pEGFP-GADD45a后显著提高了GADD45a蛋白表达水平，也显著提高了GFP的表达图8；荧光显微镜观察结果表明，GADD45a主要集中在细胞核中图9。结果提示，可以用于示踪GADD45a在293T细胞中的亚细胞定位。三猪GADD45a在猪IPEC-J2细胞中的表达及亚细胞定位研究猪IPEC-J2细胞铺板后，同时转染pEGFP-GADD45a和pEGFP-N1质粒，并设空白对照组。转染实验操作同上。转染48h后，进行Westernblot和免疫荧光检测。结果为：转染48h后，WesternBlot检测结果表明，与对照组相比，转染pEGFP-GADD45a和pEGFP-N1质粒的细胞中有较高的GFP表达。与空白对照和转染pEGFP-N1质粒组，转染pEGFP-GADD45a后显著提高了GADD45a的表达图10。免疫荧光检测结果表明，GADD45a在猪IPEC-J2细胞中主要定位于细胞核中图11。结果提示，可以用于示踪GADD45a在IPEC-J2细胞中的亚细胞定位。四猪GADD45a在猪脂肪细胞中的表达及亚细胞定位研究猪原代脂肪细胞铺板后，转染pEGFP-GADD45a质粒，并设空白对照组。转染实验操作同上。转染48h后，进行Westernblot和免疫荧光检测。结果为：转染48h后，WesternBlot检测结果表明，与对照组相比，转染pEGFP-GADD45a细胞中有较高的GADD45a的表达图12。免疫荧光检测结果表明，GADD45a在猪脂肪细胞中定位主要在细胞核中，但细胞质中也有部分表达图13。结果提示，可以用于示踪GADD45a在猪脂肪细胞中的亚细胞定位。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表浙江大学示踪猪GADD45a亚细胞定位的方法及用途4SIPOSequenceListing1.0123DNA人工序列ArtificialSequence1atgactttggaggaattctcggc23226DNA人工序列ArtificialSequence2tcaccgttcaggaagattaatcactg26348DNA人工序列ArtificialSequence3ctaccggactcagatctcgagccaccatgactttggaggaattctcgg48445DNA人工序列ArtificialSequence4aattcgaagcttgagctcgagccgttcaggaagattaatcactgg45

权利要求：1.一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：1、根据pEGFP-N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP-N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；2、GADD45a荧光示踪表达载体的构建：将利用含有载体末端15-25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP-N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。2.根据权利要求1所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：引物Ⅰ为：GADD45a-F：ATGACTTTGGAGGAATTCTCGGCGADD45a-R：TCACCGTTCAGGAAGATTAATCACTG引物Ⅱ为：XhoI-GADD45a-F：ctaccggactcagatctcgagccaccATGACTTTGGAGGAATTCTCGGXhoI-GADD45a-R：aattcgaagcttgagctcgagCCGTTCAGGAAGATTAATCACTGG。3.根据权利要求2所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：所述步骤2为：将pEGFP-N1质粒进行XhoI酶切线性化后，使用TreliefTMSoSooCloningKitVer.2试剂盒与含有同源臂的GADD45a基因引物PCR扩增产物进行同源重组，并采用热激转化大肠杆菌，得到pEGFP-GADD45a的重组质粒。4.根据权利要求1～3任一所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，其特征是：将步骤2所得的表达载体进行鉴定：通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为GADD45a全长引物；测序引物为CMV-F和PEGFP-N3引物，分别为5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’和5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’。5.如权利要求1～4任一所述的猪GADD45a荧光示踪表达载体的用途，其特征是：用于研究示踪猪GADD45a在不同细胞中的定位。6.根据权利要求5所述的用途，其特征是：用于研究猪GADD45a在不同细胞种类中的亚细胞定位。7.根据权利要求6所述的用途，其特征是包括以下步骤：1、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；2、将含猪pEGFP-GADD45a表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞、IPEC-J2等细胞，37℃，5％的CO2中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；3、转染48h后，分析GADD45a表达情况及其亚细胞定位，研究其亚细胞定位和功能调控。

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