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申请/专利权人：中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所;中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所;河北医科大学第二医院

摘要：本发明公开了一种抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株及其应用。本发明所述一种抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的分类命名为：IER5基因单抗细胞IER5‑mono‑antibody，已于2014年3月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，其生物保藏号为CGMCC No.8857；本发明还提供了上述杂交瘤细胞株分泌的抗IER5蛋白的单克隆抗体。实验表明：本发明抗IER5蛋白的单克隆抗体特异性强、灵敏度高，能检测出Hela、Siha、HepG2、MCF‑7以及宫颈癌组织中的IER5基因，能应用于制备诊断、预防或治疗肿瘤药物或制剂中。

主权项：一种抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株的分类命名为：IER5基因单抗细胞IER5‑mono‑antibody，保藏号为：CGMCC No.8857。

全文数据：一种抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株及其应用，属于单克隆抗体的技术领域。背景技术[0002]IER5是Immediateearlyresponse5的简称，属于早期慢反应基因家族，早期反应基因的激活是细胞和染色体对外在刺激反应最初和最重要的一步。人的该基因位于1号染色体上lq25.3,编号为NM_016545，cDNA全长2369bp。研究显示IER5基因存在于一些肿瘤和正常组织中，其表达变化会影响到细胞周期和凋亡。[0003]恶性肿瘤是中国病死率最高的疾病，每年约130万人死于癌症。恶性肿瘤的发生与某些特定基因的改变密切相关。生理状态下，癌基因、抑癌基因及一些生长因子的共同调控维持着上皮细胞的增殖和凋亡之间的动态平衡，一旦这种平衡被破坏将导致细胞信号传导、细胞周期和分化调控异常等，进而引起细胞增殖失控，凋亡受阻，分化异常，最终导致肿瘤的形成。前期研究发现IER5基因具有辐射敏感性，一定的辐射作用可以促进IER5基因mRNA水平高表达，这种mRNA高表达可抑制细胞的生长，促进细胞调亡。辐射不仅使肿瘤细胞如HepG2、Hela中IER5基因表达上调，并且在接受放疗后的消化系统恶性肿瘤如胃癌、肝癌、结直肠癌、食管癌以及女性生殖系统恶性肿瘤如宫颈癌中均可见其过表达现象。[0004]IER5基因作为一种较为新起研究的癌症基因，一直被广大科研工作者关注，但研究IER5的手段尚缺乏，其生物学功能及信号通路至今尚不明确。目前使用的商品化的抗IER5多克隆抗体有在运行中尚有一定的局限性。因此研究抗IER5单克隆抗体将更有助于揭示IER5的生物学功能，研究该分子在肿瘤的发生、发展中的机制，为临床恶性肿瘤的治疗提供依据。发明内容[0005]本发明的目的之一在于提供一种分泌抗IER5蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；[0006]一种抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的分类命名为：IER5基因单抗细胞IER5-mono_antibody，已于2014年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称=CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.8857。[0007]本发明的目的之二在于提供了一种抗IER5蛋白的单克隆抗体；[0008]所述单克隆抗体由上述单抗杂交瘤细胞株所分泌。[0009]本发明的目的之三在于提供上述抗IER5蛋白的单克隆抗体或杂交瘤细胞的应用：[0010]上述单抗杂交瘤细胞株在制备检测或诊断IER5蛋白的药物或制剂中的应用。[0011]上述单抗杂交瘤细胞株在制备预防或治疗肿瘤的药物或制剂中的应用。[0012]上述单克隆抗体在制备检测或诊断IER5蛋白的药物或制剂中的应用。[0013]上述单克隆抗体在制备预防或治疗肿瘤药物或制剂中的应用。[0014]上述应用中，所述的肿瘤为肝癌、宫颈癌或乳腺癌。[0015]一种检测或诊断IER5蛋白的试剂盒，包含上述的单克隆抗体。[0016]本发明的有益效果：[0017]本发明的抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株分泌的抗IER5蛋白的单克隆抗体特异强、灵敏度高；能有效检测他1&、311^、!1叩62、10^7肝癌、宫颈癌或乳腺癌）以及宫颈癌组织中的IER5,可以用于制备诊断或检测抗IER5蛋白以及预防或治疗肿瘤的药物或制剂中。[0018]生物材料保藏说明[0019]本发明的单抗杂交瘤细胞株：IER5基因单抗细胞IER5-mono_antibody保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，保藏中心登记入册编号分别为CGMCCNo.8857,保藏日期为:2014年3月7日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。附图说明[0020]图1为表达质粒酶切验证电泳图，其中：M:DM5000Marker，从上到下依次是5000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，IOObp;1:未酶切质粒pET28a::IER5-A4;2:pET28a::IER5-A4以BamHIHindm双酶切；3:未酶切质粒pET28a::IER5-B5;4:pET28a::IER5-B5以BamHIHindm双酶切。[0021]图2为小剂量试表达结果；[0022]图3为正常剂量表达结果；[0023]图4为离子交换层析图，其中，A:为IER5-A和IER5-B蛋白层析图；B:为IER5-A和IER5-B蛋白收集区域;其中A4为IER5-A蛋白，B5为IER5-B蛋白）[0024]图5为IER5-A，IER5-B蛋白最终纯化纯度图，其中，箭头所指为肽指纹图谱鉴定的条带；[0025]图6为肽指纹图谱验证纯化得到的蛋白；A:IER5-A;B:IER5-B;[0026]图7为WesternBlot检测内源表达结果，M:Marker，I:Hela细胞，2:待检样品；[0027]其中，A:尾血1653A-1WB检测；B:尾血1653A-2WB检测；C:尾血1653A-3WB检测；D:尾血1653B-1WB检测；E:尾血1653B-2WB检测；F:尾血1653B-3WB检测；[0028]图8为抗体纯度检测结果；[0029]图9为抗体检测各种细胞组织中IER5;其中，A:Hela;B:Siha;C:!fepG2;D:MCF-7;E:宫颈癌组织样品。具体实施方式[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。以下实施例中未注明实验条件或方法的部分，请参阅《分子克隆实验指南第二版》或按照试剂盒说明书进行。[0031]实施例1IER5重组表达质粒的构建[0032]由于以人基因组DNA作为模板，分别以IER5-AFAR，IER5-BFBR为引物，分别扩增IER5-A和IER5-B基因片段序列请见表2，回收目的片段，与T载体连接、转化，挑取阳性克隆，测序，将连接T载体测序正确的克隆，双酶切后与pET28a载体连接，构建IER5重组表达质rnn.^RiL〇〇59J实施例2IER5重组蚩白的表达和纯化[0060]1、转染HEK293T细胞[0061]将重组的pET28a::IER5-A和pET28a::IER5-B质粒用脂质体转染预先铺好长至80%HEK293T细胞的6孔板，整个过程用按试剂盒Lipofectamine2000™说明书进行操作。转染6小时后换含10%FBS的DMEM进行培养继续于37°C、5%C〇2孵箱中培养。[0062]2、裂解细胞[0063]转染48小时后，进行细胞裂解，弃培养基，加入3mlPBS进行漂洗，弃I3BS，洗三遍。胰酶消化收集细胞至1.5mlEP管内，1000rpmJmin13PBS重悬，1000rpm，3min。加入IOOul裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF。置于冰盒内裂解IOmin，4°C离心15min，收集上清。[0064]3、IER5-A和IER5-B转化Rosetta感受态细胞[0065]1取IOOul装Rosetta感受态细胞冰浴30min;2每支感受态细胞中分别加IOOng的pET28a::IER5-A和pET28a::IER5-B质粒，继续冰浴30min;⑶42°C水浴热激90sec，立即冰浴5min，再加500ul37°C预热的LB培养基，37°C培养1小时；⑷低速离心，吸取550ul的上清溶液，留大约50ul溶液重悬沉淀细胞，涂布到Amp抗性平板中，37°C，恒温箱培养16小时；5挑去单菌落菌斑，4mlLB中，37°C培养至OD约0.6，保存10%甘油菌种，标记清楚名称、时间等，保存_80°C冰箱。[0066]4、小量表达方法[0067]1取-80°C冰箱ffiR5_A和IER5-BRosetta菌种，按0·1%接种到LB培养基中，37°C震荡培养活化16小时；（2取活化好的菌液按1%转接到若干150mlLB培养瓶中，37°C震荡培养至OD=O.6;3加终浓度0.1mMIPTG到LB中，分别37°C和16°C继续诱导表达培养；（437°C诱导表达分别1，2，4小时取样保存；16°C诱导表达分别1，2，4，8，20小时取样保存；（5取样样品电泳检测，结果无明显表达；（6去IOml样品，裂解后在4°C环境中与Ni柱亲和层析1小时，20Mm咪唑洗涤3次后，取ΝΙ-beads电泳。[0068]收到IER5-A和IER5-B质粒，含His-tag理论分子量分别为24kD和25kD，含His-tag理论等电点分别为5.16和4.93;转化Rosetta感受态，首先进行小量试表达，采用150ml小瓶，ODO.6~0.8之间0.1mMIPTG诱导，37°诱导l24h分别取样，16°诱导l24820h分别取样，均未见到明显表达；取IOml湿菌进行小量破碎，lysisbuffer为PBS，挂50μ1IDAbeads，4°结合Ih后用20mM咪唑洗脱三次，beads直接制样跑胶，同时用anti-His抗体进行western检测，结果如图2所示;A指示处为蛋白IER5-A，表观分子量约为40kD;B指示处为蛋白IER5-B，表观分子量35kD;western结果与考染结果相符。[0069]5、正常量表达与纯化[0070]1取-80°C冰箱IER5-A4和IER5-B5Rosetta菌种，按0·1%接种到含Kan抗性的LB培养基中，37°C震荡培养活化16小时；（2分别转接到4个含Kana抗性的800mlLB培养瓶中，37°C培养至OD=O.6，0.ImMIPTG37°C诱导表达4小时，低温离心收菌；（3用80ml破碎buffer20mMTris8.0，150mMNaCl重悬，超声破碎，18,000rpmXIh;收集上清溶液。用50mMTris-HClPh8.0溶液平衡2mlNi-IDAbeads;5上清与2mlNi-IDAbeads4°孵育Ih，流穿；100mL的20mM咪唑洗涤；50ml的50mM咪唑洗涤；20ml的IOOmM咪唑洗脱；20ml的200mM咪唑洗脱，电泳。结果见图3。[0071]6、离子交换层析[0072]INi柱之后的蛋白做肽指纹图谱发现有目的蛋白，但是有杂蛋白干扰，过Q阴离子柱除去杂蛋白；（2分别合并IER5-A4ER5-B5的IOOmM和200mM咪唑洗脱液，浓缩至约2ml，加入破碎buffer至终体积20ml，此时蛋白液中的咪挫浓度被稀释至86;2将IER5-AIER5-B的序列进行理论酶解后与IER5-AIER5-B的肽指纹图谱峰图对比，发现其中有IER5-AIER5-B的理论酶解峰，因此判断纯化得到的蛋白中含目的蛋白IER5-A1ER5-B，但有杂蛋白的干扰。[0080]实施例3单抗的筛选与制备[0081]1、实验方法[0082]1.1动物免疫[0083]将上述纯化的IER5重组蛋白IER5-A命名为S1653A和IER5-B命名为S1653B以完全弗氏左剂乳化取80ug的蛋白，蛋白和佐剂的比例为1:1，总体积为250ul，采用背部皮下多点注射方法免疫6只雌性BALBC小鼠，免疫剂量为SOug只。间隔两周后进行第二次免疫以不完全弗氏左剂乳化，免疫剂量为40ug只。免疫三次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价。根据结果进行终加强免疫，免疫剂量为SOug只，脾内加强，经三次免疫后的小鼠用酶联免疫吸附法ELISA检测血清效价和用WesternBlot检测抗血清，选取抗体效价最尚的小鼠进彳丁细胞融合：[0084]1酶联免疫吸附法ELISA[0085]1包被:2ugml抗原浓度，IOOul孔，4°C过夜，洗液洗涤3次；⑵封闭：加150ul孔封闭液，37°C2小时后，洗涤3次，拍干。置4°C冰箱保存备用；⑶加待测样品:①对于血清抗体腹水效价检测，第一个孔1:1000稀释，往下以1:3的梯度倍比稀释，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。②对于细胞上清检测，吸取细胞上清IOOul，加入对应的酶标板中，37°C孵育30min，洗板4次，拍干；⑷加二抗:取辣根酶标记的羊抗鼠IgGIgG特异二抗按1:5000倍稀释后，IOOul孔，37°C孵育20至30min，洗涤4次，拍干；（5显色：稀释20XTMB至IXTMB，按IOOul孔加入，37°C显色15-30min;6终止:加入终止液（2MH2S〇450ul孔；（7读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值PN大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。[0086]2WesternBlot检测抗血清[0087]1电泳：上样4ug，Marker4ul;先90V电泳lh，后150V至结束。⑵转膜:0.45um孔径的NC膜，湿转，50mA恒流转膜50分钟；（3丽春红染色⑷封闭：用WesternBlot封闭液Π，室温封闭30min;5孵育一抗:上清或抗体稀释液（1:1000，室温孵育30min后，放于4°C过夜）；（6洗膜:TBST洗膜5次，每次3min。⑴孵育二抗:加羊抗小鼠IgG，1:10000稀释，室温孵育40mim;⑶洗膜:TBST洗膜5次，每次3min;9显色、曝光:ECLWesternBlotKit高灵敏度化学发光检测试剂盒。[0088]1.2细胞融合[0089]⑴细胞融合:选取抗体效价最高的小鼠于终加强，三日后PEG常规融合方法进行细胞融合。共铺5块板，第8天进行细胞上清检测；（2融合筛选:于融合后的第3,6天换液处理，于融合后第7-14天筛选融合细胞:采用间接ELISA方法对融合细胞上清筛选，经过两次筛选最终确认阳性细胞孔进行单克隆化。[0090]1.3亚克隆及建株[0091]采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆，待细胞集落生长至显微镜视野13时吸取上清进行筛选。待亚克隆阳性率达到100%时，正式建株，每株细胞冻存5支以上。[0092]1.4亚型检测[0093]抗体亚型的检测试剂盒由SouthernBiotech公司生产，具体实验方法参照厂家说明书。[0094]1.5阳性杂交瘤细胞株腹水制备及腹水效价检测[0095]取2只BALBC小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞效价较高同时细胞状态好重悬于无血清培养基中，按IXIO6个细胞〇.5ml只量注射石蜡小鼠，注射细胞约7-14天后收集腹水。用酶联免疫吸附法ELISA检测腹水效价。[0096]1.7腹水纯化及抗体效价检测[0097]1平衡：用BindingBuffer平衡proteinG亲和柱至基线平稳；（2上样：将腹水样品上柱，收集流穿液;将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。（3洗脱:加入ElutingBuffer洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测纯度；⑷用0.01M，pH7.2PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0.01M，pH7.2PBS环境中；（5用蛋白定量检测仪测定纯化后单抗的浓度；（6SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度，抗体上样量:8ug;7酶联免疫吸附法ELISA进行抗体效价检测。[0098]1.8用制备的抗体WesternBlot检测细胞、组织中的IER5。[0099]2、实验结果[0100]2.1动物免疫[0101]经三次免疫后小鼠血清效价的ELISA检测结果见表3和表4:IER5构建表达片段蛋白第三次免疫小鼠后，ELISA效价非常高，都达到了720000，均达到融合标准。[0102]表3三次免疫后小鼠血清效价包被抗原：IER5A[0107]注：同表3。[0108]实验结论:ELISA检测小鼠尾血效价都达到融合标准，后续将进行WB检测内源表达，根据WB检测内源结果来确定用哪只小鼠进行后续融合。WesternBlot结果见图7,从图中可以看出：IER5A小鼠呈阴性反应，IER5B1号、2号呈阳性反应，因1号小鼠融合失败，2号小鼠可以检测到阳性IER5条带42kD，故选择此小鼠进行细胞融合。[0109]2.2细胞融合[0110]融合后的第3天及第6天对融合板换液，于第7天对融合细胞板筛选，筛选结果见表5-9：[0111]表5融合细胞板筛选板1

权利要求：1.一种抗IER5蛋白的单抗杂交瘤细胞株，其特征在于:所述杂交瘤细胞株的分类命名为：IER5基因单抗细胞（IER5-mon〇-antibody，保藏号为:CGMCCNo.8857。2.由权利要求1所述的单抗杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体。3.权利要求1所述的单抗杂交瘤细胞株在制备检测或诊断IER5蛋白的药物或制剂中的应用。4.权利要求1所述的单抗杂交瘤细胞株在制备预防或治疗肿瘤的药物或制剂中的应用。5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或诊断IER5蛋白的药物或制剂中的应用。6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备预防或治疗肿瘤药物或制剂中的应用。7.根据权利要求4或6所述的应用，其特征在于:所述的肿瘤为肝癌、宫颈癌或乳腺癌。8.-种检测或诊断IER5蛋白的试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的单克隆抗体。

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