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申请/专利权人：慕尼黑工业大学附属伊萨右岸医院

摘要：本发明涉及包含水疱性口炎病毒VSV的重组溶瘤病毒，其中VSV的糖蛋白G蛋白缺失；其包含新城疫病毒NDV的修饰融合蛋白F蛋白；以及NDV的血凝素‑神经氨酸酶HN蛋白。本发明进一步涉及编码重组溶瘤病毒的核酸和包含该核酸的载体。本发明进一步涉及包含本发明的rVSV、核酸或载体的药物组合物，还作为基因递送工具和或用于肿瘤检测。本发明还涉及用于医学，特别是用于癌症的诊断、预防和或治疗重组溶瘤性水疱性口炎病毒VSV。

主权项：1.一种重组溶瘤水疱性口炎病毒（VSV），其中VSV的糖蛋白缺失，并且所述水疱性口炎病毒（VSV）包含新城疫病毒（NDV）的修饰融合蛋白；以及NDV的血凝素神经氨酸酶（HN）蛋白，其中VSV缺失的所述糖蛋白被所述NDV的修饰融合蛋白和所述NDV的HN蛋白所取代；其中所述NDV的修饰融合蛋白是F3aa修饰的F蛋白，并且在蛋白酶剪切位点包含氨基酸取代L289A；其中所述NDV的修饰融合蛋白由SEQIDNO.12的氨基酸序列组成，和或其中所述NDV的修饰融合蛋白由SEQIDNO.11的核苷酸序列编码；其中所述NDV的HN蛋白由SEQIDNO.6的氨基酸序列组成，和或其中所述NDV的HN蛋白由SEQIDNO.5的核苷酸序列编码；并且其中所述水疱性口炎病毒（VSV）还包含大聚合酶蛋白、磷蛋白、基质蛋白和核蛋白。

全文数据：用于肿瘤溶瘤治疗的VSVNDV杂合病毒本发明涉及包含水疱性口炎病毒VSV的重组溶瘤病毒，其中VSV的糖蛋白G蛋白缺失；其包含新城疫病毒NDV的修饰融合蛋白F蛋白；以及NDV的血凝素-神经氨酸酶HN蛋白。本发明进一步涉及编码重组溶瘤病毒的核酸和包含该核酸的载体。本发明进一步涉及包含本发明的rVSV、核酸或载体的药物组合物，还作为基因递送工具和或用于肿瘤检测。本发明还涉及用于医学，特别是用于癌症的诊断、预防和或治疗重组溶瘤性水疱性口炎病毒VSV。背景技术溶瘤病毒OVS代表一类新型的肿瘤治疗药物，因为其固有的选择性复制和杀死肿瘤细胞的能力，同时可保护周围的正常组织Lorenceetal.，1994；Coffeyetal.，1998；Kirnetal.，2001；Pengetal.，2001。OV疗法涉及使用具有复制能力的病毒，这些病毒具有固有的肿瘤选择性，或已经被设计成优先在肿瘤细胞中生长的。在恶性转化过程中，基因异常积累为癌细胞提供了生长和生存优势。许多OV利用这些在细胞信号通路中的这些缺陷支持其在这些细胞中的自身复制。特别是许多癌细胞在分泌或应答干扰素IFN的能力方面受到损害，而干扰素是抵抗病毒入侵正常细胞的先天免疫应答的关键机制。这些缺陷阻止肿瘤细胞建立有效的抗病毒防御，因此，在这些细胞中OV的复制得到了特异性支持。溶瘤病毒通过直接杀死受感染的肿瘤细胞发挥其作用，以及间接的作用，例如破坏肿瘤血管和诱导适应性免疫应答，其可针对肿瘤并导致邻近未感染的肿瘤细胞的破坏。此外，遗传系统是可用的，这使得我们能够从质粒DNA中设计和拯救重组病毒载体。如此，病毒可以被修饰以增加肿瘤特异性或表达治疗基因和或报告基因。在过去的十年中，增强型OV疗法的发展取得了重大进展，并且各种载体已经进入临床试验Kirnetal.，2001；EvertsandvanderPoel，2005；PatelandKratzke，2013。最近，重组单纯疱疹病毒I型载体是第一个被FDA批准作为临床药物使用的溶瘤病毒安进，2015年10月27日新闻，预计随后将在欧洲获得批准。然而，一般来说，因为缺乏可靠和预测性的临床前模型，以及由于在免疫能力强的宿主中对大多数OV疗法的肿瘤反应不足，临床试验结果往往令人失望。溶瘤病毒疗法的治疗效果通常与安全性进行权衡，使得有效的载体通常与毒性相关，而更安全的病毒提供的治疗效果有所减弱。尽管有良好的临床前数据，但是由于在啮齿动物和非人类灵长类动物中观察到野生型VSV治疗引起的严重神经毒性vandenPooletal.，2002；Johnsonetal.，2007，水疱性口炎病毒VSV作为临床药物的发展受到很大阻碍。除了安全性方面，由于其短生命周期的结果，VSV的高瘤内滴度的快速积累导致了早期和强有力的先天免疫应答，严重限制了病毒被从宿主清除前的有效扩散和破坏整个肿瘤块的能力Altomonteetal.，2008。新城疫病毒NDV已被证明是一种有效的溶瘤剂，具有很好的人体安全性；然而，NDV的使用给鸟类和家禽业带来了环境风险，因为禽类是病毒的天然宿主。虽然中型和快速型NDV株已被证明是最有效的溶瘤病毒，但美国农业部自2008年起将其列为受管制物质，禁止其使用，从而严重阻碍NDV向临床试剂的开发www.selectagents.gov。研究人员已经研究了多种方法来提高溶瘤VSV载体的安全性。首先，含有核苷酸取代或缺失以改变第51位基质M蛋白氨基酸组成的重组VSV干扰了内源性M蛋白抑制细胞转录和核细胞质RNA转移的能力，从而启动抗病毒细胞反应。尽管这些载体已被证明比野生型安全，但其肿瘤内的复制也减弱了Stojdletal.，2003；Ebertetal.，2005，限制了这种方法的治疗价值。另一种提高VSV安全性的策略包括将miRNA靶序列整合到病毒基因组中以修饰病毒的嗜性，但是这些载体也较差Edgeetal.，2008；Kellyetal.，2010。现在正在探索各种各样的方法来设计NDV基因组以限制其在禽类的致病性，见于例如专利申请号WO2015032755A1。这些修饰是否会真正提高安全性以及这些修饰对载体溶瘤能力的影响还有待观察。因此，本领域需要改进的溶瘤病毒治疗的手段和方法，以及改进的溶瘤病毒。发明内容根据本发明，此目的可通过重组溶瘤病毒来解决，包含水疱性口炎病毒VSV，其中VSV糖蛋白G蛋白缺失，并且所述水疱性口炎病毒VSV包含新城疫病毒NDV的修饰融合蛋白F蛋白；以及NDV的血凝素神经氨酸酶HN蛋白。根据本发明，此目的可通过本发明编码重组溶瘤病毒的核酸来解决。根据本发明，此目的可通过本发明包含核酸的载体来解决。根据本发明，此目的可通过药物组合物来解决，其包含：i本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体；以及ii可选地，药物学上可接受的载体和或赋形剂。根据本发明，此目的可通过使用本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体，或通过本发明的作为基因递送工具的药物组合物，和或非侵入性的病毒的生物分布成像，和或肿瘤检测来解决。根据本发明，此目的可通过提供医用的本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体，或本发明的药物组合物来解决。根据本发明，此目的可通过提供用于癌症诊断、预防和或治疗的本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体，或本发明的药物组合物来解决。根据本发明，此目的可通过癌症诊断、预防和或治疗的方法来解决，该方法包括步骤为向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体或本发明的药物组合物。具体实施方式在下面更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明并不限于本文所描述的特定的方法、方案和试剂，因为这些均可变化。还应理解，这里所用的术语仅仅是为了描述具体实施例的目的，而非意图限制本发明的范围，其仅可受限于附加的权利要求。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域普通技术人员通常理解相同的含义。为本发明的目的，本文所引用的全部文献均以全文引用方式整体并入本文。浓度、数量和其他数据在本文中可以在一个范围格式内表达或呈现。应当理解，这种范围格式仅为了方便和简洁，因此应当被灵活地解释，以不仅包括明确地列举为范围限制的数值，还包括该范围中包括的所有单独数值或子范围，就如同每个数值和子范围被明确地列举一般。作为一个例证，“20至100个核苷酸”的数值范围应被解释为不仅包括明确列举的20至100的值，而且还包括在所指范围内的单独值和子范围。因此，此数值范围中包括诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、...97、98、100的单独值以及诸如从25至35、从20至40、从25至50等的子范围。同样的原理适用于只列举一个数值的范围，例如“至少25个核苷酸”。此外，这种解释的应用应受所描述的范围广度或特征的拘束。溶瘤病毒和VSV载体如上所述，本发明提供重组溶瘤病毒。具体的，本发明提供重组溶瘤性VSV病毒，其中VSV的糖蛋白是假型的。正在开发的最有前途的OV载体平台是水疱性口炎病毒VSV和新城疫病毒NDV。水疱性口炎病毒VSV是弹状病毒家族的一个负链RNA病毒。VSV载体由于其固有的肿瘤特异性和快速的复制周期而成为极具吸引力的溶瘤剂，其导致较高的肿瘤内滴度和随后的肿瘤细胞裂解。VSV的基因组是单分子的负链RNA，编码五种主要蛋白质：糖蛋白G、大聚合酶蛋白L、磷蛋白P、基质蛋白M和核蛋白N。总基因组约为11,000个核苷酸。VSVG蛋白使病毒能够进入。它介导病毒附着到存在于宿主细胞上的LDL受体LDLR或LDLR家族成员。结合后VSV-LDLR复合物后快速被内吞。它随后介导病毒包膜与内体膜的融合。VSV通过部分网格蛋白包被囊泡进入细胞；含病毒的囊泡比常规囊泡含有更多的网格蛋白和网格蛋白接头。含有病毒的囊泡招募肌动蛋白机器的组分用于相互作用，从而诱导其自身摄取。复制发生在细胞质中。VSVL蛋白由基因组的一半编码，并与磷蛋白结合以催化mRNA的复制。VSVM蛋白由831个核苷酸长的mRNA编码并翻译成229个氨基酸的蛋白质。预测的M蛋白序列不包含任何可能促进膜结合的长疏水或非极性结构域。蛋白质富含碱性氨基酸，并含有一个高度碱性的氨基末端结构域。VSVIndiana型完整基因组SEQIDNO.1NCBIGenBank编号J02428.1VSVIndiana型G蛋白SEQIDNO.2和3核苷酸和氨基酸序列参见GenBank编号X03633.1。新城疫病毒NDV是副粘病毒家族的禽病毒。该家族的成员具有单链线性RNA。总基因组约为16,000个核苷酸。病毒的复制发生在宿主细胞的细胞质中。类似于VSV，因为它是负链RNA病毒，并且由于其固有的在肿瘤细胞中复制和导致裂解的能力，而作为溶瘤病毒被开发出来，同时使健康细胞不受伤害Altomonteetal.，2010；Vigiletal.，2007。I-II期临床试验已显示出NDV的前景，并提示与治疗相关的毒性极小。新城疫病毒作为溶瘤剂的一个主要益处是，由血凝素-神经氨酸酶HN和融合蛋白F组成的病毒包膜不仅介导病毒向靶细胞的附着和融合，而且导致受感染细胞与相邻未受感染细胞的融合，为病毒扩散和肿瘤细胞杀伤提供强有力的机制。此外，新的证据表明，由细胞-细胞融合引起的合胞体形成导致多模态细胞死亡应答，该应答可与病毒的直接溶瘤作用协同作用，从而形成有效的肿瘤破坏机制Cuadrado-Castanoetal.，2015。新城疫病毒有两种蛋白被插入到了包膜内。它们是血凝素神经氨酸酶蛋白IIN和融合蛋白F。这两种蛋白在确定病毒的毒性以及病毒如何感染宿主细胞方面很重要。血凝素神经氨酸酶蛋白有两个有趣的部分：1血凝素部分，其是附着蛋白并且与包括红细胞在内的宿主细胞外膜的受体结合。2神经氨酸酶部分是一种酶的活性位点，有助于从宿主细胞膜释放病毒。该酶的活性影响了病毒从红细胞中洗脱所需的时间。融合蛋白F将病毒包膜融合到宿主细胞的膜上。这允许通过病毒基因组侵入到宿主细胞。为了使融合发生，必须改变天然融合蛋白的形状。当宿主细胞蛋白酶在特定的剪切位点剪切蛋白质时发生这种改变。这种情况发生后，融合蛋白被激活，且此时即可融合到细胞膜上。切割位点周围的氨基酸序列决定了能够激活蛋白质剪切的蛋白酶的范围。因此，该序列决定病毒毒性。NDVF蛋白是负责与细胞膜的病毒融合，并通过合胞体的形成使病毒从细胞传播到细胞。在F蛋白内存在多碱性剪切位点以允许被广泛的蛋白酶蛋白质剪切和激活，并且是强毒性病毒株毒性的决定因素。为了增强高度减弱的弱毒性HitchnerB1NDV株的溶瘤能力，在F蛋白中引入了多碱性剪切位点以产生rNDVF3aaVigiletal.，2007。根据胚胎卵中的平均死亡时间所得到的病毒仅显示出中等毒性表型，然而该病毒形成大的合胞体，并增强了其在癌细胞中的复制，从而增强了在各种动物肿瘤模型中的溶瘤作用。当以类似的方式修饰弱毒性NDVLaSota株的F蛋白时，会显示类似的结果Peetersetal.，1999。发明者进一步证明，与只携带F3aa突变的病毒相比，F3aa修饰的融合蛋白氨基酸289处从亮氨酸到丙氨酸的单个氨基酸取代L298A导致了实质上更大的合胞体形成和肿瘤坏死，并且没有任何附加毒性Altomonteetal.，2010。rNDVF3aa株的融合活性和溶瘤活性可通过F蛋白中残基289亮氨酸到丙氨酸的点突变进一步增强，产生rNDVF3aaL289A。在原位免疫活性肝肿瘤的大鼠模型中，经肝动脉输注突变病毒导致显著的合胞体形成和坏死，转化成为了比用原始rNDVF3aa病毒治疗显著延长20％的生存期Altomonteetal.，2010。NDVHitchnerB1型完整基因组SEQIDNO.4GenBank编号AF375823NDVHN蛋白SEQIDNOs.5和6核苷酸和氨基酸序列参见GenBank编号AF375823和NCBIGene识别号912270。NDVF蛋白SEQIDNOs.7和8核苷酸和氨基酸序列参见GenBank编号AF375823和NCBIGene识别号912271。SEQIDNO.8NDVF3aa修饰融合蛋白SEQIDNO.9和10SEQIDNO.9Parketal.，2006和Altomonteetal.，2010SEQIDNO.10Parketal.，2006和Altomonteetal.，2010NDV含L289A的F3aa修饰融合蛋白SEQIDNO.11和12SEQIDNO.11参见Altomonteetal.，2010SEQIDNO.12参见Altomonteetal.，2010如上所述，本发明提供重组溶瘤性VSV病毒，其中VSV的糖蛋白是假型蛋白。最近，将病毒的糖蛋白“假型化”与异源病毒的糖蛋白交换的概念已被证明是改变病毒嗜性的有效手段。使用这种方法，病毒骨架保持完整，因此，可猜测病毒在易感细胞中的复制应受到最小的影响。有一个团队描述了一种VSV载体，它用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV-GP的包膜蛋白进行假型化，该载体已显示出比野生型载体明显具有更小的嗜神经性Muiketal.，2011。类似地，VSV糖蛋白已经与麻疹病毒交换并用单链可变抗体片段修饰，以将VSV靶向于表达不同的表面受体的癌细胞Muiketal.，2011。在本发明中，提供了重组溶瘤病毒，包含水疱性口炎病毒VSV，其中VSV的糖蛋白被缺失，并且其包含新城疫病毒NDV的修饰融合蛋白F蛋白；以及NDV的血凝素神经氨酸酶HN蛋白。在优选实施例中，NDV的修饰融合蛋白F蛋白是F3aa修饰的F蛋白，和或在蛋白酶剪切位点包含至少一个氨基酸取代，优选是L289位置，例如L289A。在优选实施例中，VSV的G蛋白被修饰的融合蛋白和NDV的HN蛋白所取代。重组溶瘤病毒进一步包含VSV的其余蛋白，即大聚合酶蛋白L、磷蛋白P、基质蛋白M和核蛋白N。例如VSV的内源性糖蛋白可以从编码全长VSV基因组的质粒中删除。包含修饰的融合蛋白NDVFL289A和血凝素神经氨酸酶NDVHN的NDV糖蛋白可以作为离散的的转录单元插入VSV基质M和大聚合酶L基因之间。参见，如图1。在本发明的rVSV载体的一项实施例中，NDV的修饰融合蛋白F蛋白包含或由下列组成：SEQIDNO.10[＝F3aa蛋白氨基酸序列]或SEQIDNO.12[＝F3aa蛋白L289A氨基酸序列]的氨基酸序列，或由与SEQIDNO.10或12的氨基酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的氨基酸序列，和或其中NDV的修饰融合蛋白F蛋白由SEQIDNO.9[＝F3aa蛋白核苷酸序列]或SEQIDNO.11[＝F3aa蛋白L289A核苷酸序列]的核苷酸序列编码，或由与SEQIDNO.9或11的核苷酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列编码。在本发明的rVSV载体的一项实施例中，其中NDV的HN蛋白或由下列组成：SEQIDNO.6的氨基酸序列，或与SEQIDNO.6的氨基酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的氨基酸序列，和或其中NDV的HN蛋白由SEQIDNO.5的核苷酸序列或与SEQIDNO.5的核苷酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列编码。如上所述，本发明包括编码本发明溶瘤病毒的核苷酸。如上所述，本发明包括包含本发明核苷酸的载体。在优选实施例中，本发明的载体进一步包含：-报告基因，诸如HSV1-sr39TK、钠碘转运体NIS、生长抑素受体2SSTR2、荧光素酶萤火虫或海肾、绿色荧光蛋白GFP、lacZ，酪氨酸酶，-被递送到靶细胞或组织的基因，诸如被递送到肿瘤细胞或肿瘤的基因，例如免疫刺激基因，诸如IFN-α、IFN-β或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；免疫检查点抑制抗体，诸如PD-1、PD1-L、CTLA-4、LAG-3或B7-H3；和或用于疫苗接种的肿瘤相关抗原TAA的疫苗接种肿瘤特异性靶向；-或其组合。在实施例中，本发明的核苷酸或载体包含或由下列组成：SEQIDNO.13[＝全病毒载体构建体的核苷酸序列]的核苷酸序列，或与SEQIDNO.13的核苷酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列，和或包含或由下列组成：编码SEQIDNO.6、12、14至17[＝由全病毒载体构建体编码的蛋白氨基酸序列]的氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码SEQIDNO.6、12、14至17的氨基酸序列的核苷酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列。SEQIDNO.13显示全病毒载体构建体的核苷酸序列。SEQIDNO.14-17和12和6显示由SEQIDNO.13编码的蛋白的氨基酸序列，即：SEQIDNO.14蛋白VSV-N的氨基酸序列；SEQIDNO.15蛋白VSV-P的氨基酸序列；SEQIDNO.16蛋白VSV-M的氨基酸序列；SEQIDNO.12蛋白NDV-F3aaL289A的氨基酸序列；SEQIDNO.6蛋白NDV-HN的氨基酸序列；SEQIDNO.17蛋白VSV-L的氨基酸序列。药物组合物如上所述，本发明提供一种药物组合物，包含i本发明的重组溶瘤病毒或本发明的核苷酸或本发明的载体；和ii可选地，药物学可接受的载体和或赋形剂。在一个实施例中，所述药物组合物还包含其他药物，诸如化学治疗剂、放射治疗剂、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、细胞载体系统、小分子抑制剂，栓塞剂、屏蔽聚合物。在一项实施例中，所述药物组合物是配制用于全身递送、肿瘤注射、静脉内施用、动脉内施用和或用于皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹腔内、鞘内、硬膜外、心脏内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射。用作基因递送工具和或肿瘤检测如上所述，本发明提供本发明重组溶瘤病毒、核苷酸或载体或本发明药物组合物的使用-作为基因递送工具和或-非侵入性病毒的生物分布成像和或-用于肿瘤检测。在一项实施例中，本发明的载体包含被递送至靶细胞或组织的基因，诸如被递送到肿瘤细胞或肿瘤的基因，例如免疫刺激基因，诸如IFN-α、IFN-β或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；免疫检查点抑制抗体，诸如PD-1、PD1-L、CTLA-4、LAG-3或B7H3；和或用于疫苗接种的肿瘤相关抗原TAA的疫苗接种肿瘤特异性靶向。在一项实施例中，本发明的载体包含报告基因，诸如HSV1-sr39TK、钠碘转运体NIS、生长抑素受体2SSTR2、荧光素酶萤火虫或海肾、绿色荧光蛋白GFP、lacZ、酪氨酸酶，以及随后适合于例如病毒生物分布或肿瘤检测的非侵入性成像。医疗用途如上所述，本发明提供本发明的重组溶瘤病毒、核苷酸或载体或本发明的药物组合物以用于医学。如上所述，如上所述，本发明提供本发明的重组溶瘤病毒、核苷酸或载体或本发明的药物组合物以用于肿瘤的诊断、预防和或治疗。在一个实施例中，本发明提供本发明的重组溶瘤病毒、核苷酸或载体或本发明的药物组合物以用于溶瘤治疗。本文所用术语“溶瘤病毒疗法”指通过给予溶瘤病毒、编码它们的核酸或相应的载体以诱导肿瘤消退来治疗癌症。在一个实施例中，提供本发明本发明的重组溶瘤病毒、核苷酸或载体或本发明的药物组合物以与其他疗法结合使用。所述其他疗法可以是：细胞载体系统，例如T细胞、树突状细胞、NK细胞、间充质干细胞，免疫疗法，例如肿瘤疫苗或免疫检查点抑制剂，和或标准肿瘤疗法，例如射频消融、化疗、栓塞、小分子抑制剂。在一个实施例中，通过全身、静脉注射、动脉内注射、注入肿瘤施用，和或通过皮内、皮下、肌内、静脉、骨内、腹膜内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射而施用的。肿瘤诊断、预防和或治疗的方法如上所述，本发明提供一种诊断、预防和或治疗肿瘤的方法，该方法包括步骤向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体或本发明的药物组合物。本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体或本发明的药物组合物的治疗有效量是导致所需治疗效果特别是肿瘤消退的量。重组病毒、核苷酸、载体或其药物组合物优选的在一段时间内多次循环给药，例如数天至数周。在一个实施例中，通过全身、静脉注射、动脉内注射、注入肿瘤给药，和或通过皮内、皮下、肌内、静脉、骨内、腹膜内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射而施用。在一个实施例中，提供本发明的重组溶瘤病毒、核酸或载体或本发明的药物组合物并与其他疗法结合向所需受试者施用。所述其他疗法可以是：细胞载体系统，例如T细胞、树突状细胞、NK细胞、间充质干细胞，免疫疗法，例如肿瘤疫苗或免疫检查点抑制剂，和或标准肿瘤疗法，例如射频消融、化疗、栓塞、小分子抑制剂。优选实施例的进一步描述本发明公开了一种假型VSV载体，其中内源性糖蛋白缺失并与新城疫病毒NDV的修饰的包膜蛋白交换。先前已经证明，与只携带F3aa突变的病毒相比，通过引入多碱性蛋白酶剪切位点rNDVF3aa对NDVHitchnerB1株的融合蛋白进行修饰，可以在没有外源蛋白酶的情况下在广泛的细胞中有效地形成合胞体Vigiletal.，2007。我们进一步证明在F3aa修饰的融合蛋白中氨基酸289从亮氨酸到丙氨酸的单氨基酸取代L289A可引起合胞体形成和肿瘤坏死的显著增加，而没有任何附加毒性Altomonteetal.，2010。根据本发明，所述修饰的超膜融合F蛋白与NDVHN附着蛋白一起插入到VSVG-缺失的载体中。通过创建这两种有效的溶瘤载体的混合体，我们合并了每种病毒的积极特征，同时消除了每种病毒的安全问题。所得到的载体具有VSV骨架，因此维持野生型VSV的快速复制周期。此外，由于掺入新城疫病毒的HN蛋白和超融合F蛋白，重组病毒诱导增强合胞体的形成，从而允许病毒的有效肿瘤内传播，以及肿瘤细胞死亡和诱导抗肿瘤免疫应答的有效机制。使用这种策略，可以实现融合病毒的益处，而无需受与NDV相关环境的威胁。此外，由于内源性VSV糖蛋白已经被删除，因此不应有与载体相关的神经毒性。最后，由于NDV通过唾液酸残基附着在靶细胞上，而唾液酸残基在肿瘤细胞上调Bulletal.，2014，因此我们可以用假型载体实现额外的肿瘤靶向转导。尽管已经报道了许多比野生型VSV更安全的假型VSV载体，但我们的特定病毒修饰的不同之处在于，除了更安全之外，VSV包膜蛋白与NDV包膜蛋白的替换导致了更有效的病毒。此外，我们引入NDVF蛋白的突变版本，以进一步提高所得重组病毒的效力，而不会对安全性有负面影响。这种糖蛋白交换的益处有三重：1.与内源性VSV糖蛋白相关的神经向性可通过VSV包膜缺失和引入非神经向性NDV包膜蛋白来避免；2.可通过上调唾液酸残基来靶向肿瘤细胞，唾液酸残基是NDV的天然受体；以及3.病毒的传播和肿瘤细胞杀伤可以通过引入NDVF蛋白的高融合突变版本而得到显著提高。我们的构建体同时提供了安全性和有效性的改善。本发明的假型病毒与其他野生型载体相比具有改善的安全性和增强的效能。此外，在先前报道的假型VSV载体之上也有这种特殊载体的优点。虽然VSV-GP载体LCMV-GP伪型显示出增强的安全性，但是与NDV糖蛋白相比，LCMV糖蛋白没有提供额外的治疗机制Muiketal.，2011。虽然麻疹病毒MV与NDV类似，是副粘病毒家族的成员，并且其包膜也由血凝素和融合蛋白组成，但是rVSV-MV载体Ayala-Bretonetal.，2012不包含任何增加融合性的修饰，而且与我们的超融合VSV-NDV相比其在合胞体形成中的效率较低。此外，MV通过三种不同的受体与靶细胞相连：CD46、信号淋巴细胞活化分子SLAM和连接蛋白4nectin4。然而，SLAM阳性免疫细胞的感染可导致免疫抑制，感染的连接蛋白4阳性气道上皮细胞可导致呼吸道脱落及病毒传播，这两者在溶瘤病毒治疗上都会产生不良的副作用。因此，在rVSV-MV载体的背景下，作为将假型病毒重新靶向到肿瘤的策略，已经进行了阻断MVH与SLAM和连接蛋白4的相互作用Liuetal.，2014以及将附着蛋白重新靶向到肿瘤特异性受体Ayala-Bretonetal.，2012的修饰。然而，这些对MV包膜自然附着机制的限制肯定会导致重组病毒的减弱。事实上，连接蛋白4和CD46在MVH上具有相当多重叠的受体结合表面，已有显示，对连接蛋白4结合的破坏使CD46的附着受损，导致溶瘤作用的大幅减弱Liuetal.，2014。最后，由于大多数人群接种的是麻疹病毒疫苗，针对病毒包膜的高水平循环抗体可能在中和rVSV-MV载体中发挥作用。因此，我们的rVSV-NDV载体比先前报道的假型载体更为优越，因为它具有超融合性，缺乏一般人群中预先存在的免疫力，并且与VSV或NDV相比没有预期的衰减。下面的实施例和图示对本发明进行了说明，然而并没有限制本发明。附图说明图1.表达NDV糖蛋白的重组假型VSV的构建体。将VSV的内源性糖蛋白从编码全长VSV基因组的质粒中删除。将包含修饰融合蛋白NDVFL289A和血凝素-神经氨酸酶NDVHN的NDV糖蛋白作为多个转录单元插入到VSV基质M和大核酸酶L基因之间。使用建立的反向遗传学系统拯救各自的假型VSV载体。图2.rVSV-NDV可以在HCC细胞中复制并导致完全的细胞毒性。用感染复数MOI0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV感染人源HCC细胞系Huh7A，B和HepG2C，D。感染1小时后，洗涤细胞并在细胞中加入新鲜培养基。在感染后的不同时间点收集上清液等分试样，用LDH法测定细胞毒性B，D并裂解单层细胞以用TCID50法测定细胞内滴度A，C。重复进行三次实验，数据显示为平均值+-SEM。图3.rVSV-NDV的感染在HCC细胞中导致合胞体的快速形成。为了评价假型rVSV-NDV载体诱导肿瘤细胞合胞体形成的能力，用MOI为0.01的rVSV-NDV、rNDV或rVSV感染不同HCC细胞系，在感染后不同时间点用显微镜进行观察。作为对照，用PBS处理附加细胞。用Huh7细胞作为代表性的人源HCC细胞系，并在200倍放大倍数下捕获代表性图像。图4.NDV包膜蛋白的假型VSV不改变载体对IFN抗病毒作用的敏感性。为评估rVSV-NDV对I型IFN的敏感性，用M0I为0.01的rVSV-NDV、rVSV和rNDV感染IFN-敏感细胞系A549。在感染48小时后裂解细胞，用TCID50测定胞内病毒滴度。重复进行三次实验，数据显示为平均值+-SEM。图5.rVSV-NDV的复制和细胞毒性在原代肝癌细胞中显著降低。用MOI为0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV感染原代肝癌细胞。细胞裂解物在不同时间点用TCID50测定胞内病毒滴度。此外，在不同时间点收集上清液，用LDH法测定细胞毒性。重复进行两次实验，数据显示为平均值+-SEM。图6.rVSV-NDV的复制和细胞毒性在原代小鼠神经元中显著降低。用MOI为0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV感染原代小鼠神经元。细胞裂解物在不同时间点用TCID50测定胞内病毒滴度。使用标准MTS法测定额外孔中的细胞存活率。重复进行两次实验，数据显示为平均值+-SEM。图7.假型rVSV-NDV载体引起免疫原性细胞死亡。用MOI为0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV感染Huh7细胞或模拟感染48小时。浓缩条件培养基，对10μg蛋白进行蛋白印迹分析，检测HMGB1、Hsp70和Hsp90的释放。图8.假型rVSV-NDV载体与免疫缺陷小鼠中的rVSV相比具有增强的安全性。免疫缺陷雄性NOD-SCID小鼠尾静脉注射剂量为106TCID50的rVSV-NDV或rVSV-GFP在图中简单地称为rVSV。每天监测小鼠并在人道终点进行安乐死。随注射时间绘制体重变化左侧；在第1天和第7天用TCID50分析测定血液中的病毒滴度中间；由KaplanMaier存活曲线绘制存活率左侧。图9.用106TCID50的rVSV治疗的小鼠显示肝脏和脑组织病理学的改变。肝脏的HE染色显示rVSV治疗后肝细胞出现小群坏死，以肝细胞核溶解变性为特征左上图。应用rVSV后观察到脑干出现急性坏死，变性胶质细胞出现固缩和核破裂右上图。caspase-3免疫组化染色可进一步证实胶质细胞的退化右下。显示的是代表性图像，标尺为50μm。在显示毒性的迹象之后，从接受了rVSV的小鼠脑和肝组织裂解物种定量病毒滴度。数据显示为平均值+-SEM。实施例1.材料和方法1.1病毒如前所述设计和拯救表达GFP报告基因的重组VSV本文称为“rVSV”Huangetal.，2003。.如前所述设计和拯救表达GFP报告基因的含F3aaL289A的重组NDV本文称为“rNDV”Huangetal.，2003。重组rVSV-NDV是通过首先修饰编码全长VSV基因组的质粒pVSV-XN2，并表达NDV的F3aaL289A修饰的融合蛋白Ebertetal.，2004作为G基因和L基因之间的附加转录单元而产生的。用限制性内切酶MluI和XhoI消化缺失内源性VSV糖蛋白G，它们分别识别G的5’和3’非编码区的独特限制性位点。在G-缺失质粒自连之后，在NDVF基因之后的NheI独特限制性位点插入短寡核苷酸连接子，以创建用于插入HN基因的多克隆位点。用PCR从编码NDV全长基因组的质粒中扩增HN基因，利用引物分别在PCR产物的5’端和3’端引入PacI和PmeI限制性位点，以用来插入到G缺失的VSV-NDVF3aaL质粒的新整合限制性位点中。对得到的质粒进行序列分析，以确认PCR插入物，以及基因间转录起始和终止序列和基因顺序的保真度。最后，利用建立的拯救负链RNA病毒的反转基因系统拯救此处称为“rVSV-NDV”的传染性病毒Lawsonetal.，1995。可参见图1。1.2细胞系两株人源HCC细胞系HepG2和Huh-7从UlrichLauer博士德国图宾根大学医院处获得并维持在添加了10％胎牛血清FBS、1％L-谷氨酰胺200mM、1％青霉素链霉素、1％非必需氨基酸和1％丙酮酸钠的Dulbecco改良的Eagle培养基DMEM中。A549从ATCC马里兰州罗克维尔获得并培养在与HCC细胞系相同的培养基中。根据人类慈善组织控制的人类组织和细胞研究HTCR基金会德国雷根斯堡的指南，原代人源肝细胞来源于接受肝肿瘤手术切除的患者乙型肝炎病毒和C病毒和人类免疫缺陷病毒阴性。肝细胞维持在HepatoZYME-SFM培养基德国卡尔斯鲁厄，Gibco-英潍捷基中。原代胚胎原代皮质神经元从E16.5小鼠皮质分离，并由StefanLichtenthaler实验室德国慕尼黑DZNE提供。培养神经元维持在添加了B272％、0.5mM谷氨酰胺和1％青霉素链霉素的Neurobasal培养基GIBCO中。所有细胞系和原代细胞均保持在5％CO2的37℃增湿培养箱中。1.3显微分析人源HCC细胞系Huh7和HepG2在6孔板中培养至大约90％汇合度时用MOI为0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV感染或者模拟感染。在感染后16、24和48小时，在Axiovert40CFL显微镜蔡司上以200倍放大率观察细胞，并用附在显微镜上的佳能PowershotA620照相机捕捉代表性图像。1.4IFN的剂量反应测定将干扰素敏感的A549细胞置于24孔板中，密度为每孔105个细胞，培养过夜。第二天晚上，用直接添加到培养基中的不同浓度0、100、500和1000IUmL的通用I型干扰素对它们进行预处理。孵育过夜后，用感染复数MOI为0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV感染细胞。感染48小时后，用100μL的PBS收集细胞，并用三次冻融循环裂解细胞。用TCID50法分析细胞裂解物测定瘤内病毒滴度。1.5生长曲线TCID50测定在HCC细胞系Huh7和HepG2以及原代人源肝细胞和原代小鼠神经元上完成病毒生长曲线。HCC细胞系以每孔3.5×105细胞的密度在6孔培养皿中培养，而PHH和神经元以每孔105的细胞密度接种在胶原包被的24孔培养皿中。用感染复数MOI为0.01的rVSV、rNDV和rVSV-NDV感染每个细胞系。于37℃在1mL的PBS6孔板或250μL的PBS24孔板中感染1小时。孵育后，细胞用PBS洗涤三次，并加入新鲜培养基。在感染后0、16、24、48和72小时收集细胞裂解物，进行细胞内病毒滴度的TCID50分析。1.6细胞毒性试验LDH或MTS测定通过测定细胞培养上清中乳酸脱氢酶LDH的释放量，分析感染的HCC细胞系Huh7和HepG2和原代人源肝细胞的存活率。细胞的接种、感染和洗涤与生长曲线实验相同。在感染后24、48和72小时，收集上清液等分，并用CytoTox96非放射性细胞毒性试验试剂盒Promega测量LDH的释放。对于每一时间点，以最大LDH释放对照的百分比计算病毒感染后的LDH释放。从实验孔得到的值中减去模拟处理细胞上清中检测到的基线LDH水平-用MTS3-4，5-二甲基噻唑-2-基-5-3-羧基甲氧基苯基-2-4-磺基苯基-2H-四氮唑法，采用CellTiter96单溶液细胞增殖检测试剂盒威斯康星州麦迪逊，Promega分析神经元的细胞活力。将神经元接种于胶原包被的96孔培养皿中，密度为5×104细胞孔，模拟处理或感染MOI为0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV。在感染后24、48小时和72小时，根据制造商的方法测量细胞活力。用与未感染的对照组相比的差异度来计算实验样本的细胞毒性。1.7蛋白印迹Huh7细胞在6孔板中培养至大约90％汇合度时用MOI为0.01的rVSV、rNDV或rVSV-NDV感染或者模拟感染48小时。收集条件培养基并用使用10kD截留分子量的Amicon超离心过滤器马萨诸塞州比尔里卡，默克密理博浓缩至约200μL。用PierceBCA蛋白定量分析试剂盒马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔测量蛋白浓度。每个样品加载10μg到7.5％的变性SDS-PAGE凝胶上，然后转移到硝酸纤维素膜上。使用针对HMGB1和Hsp90马萨诸塞州丹弗，CellSignalingTechnology和Hsp70德克萨斯州达拉斯，圣克鲁斯生物的特异性抗体以及辣根过氧化物酶缀合的适当的二抗检测蛋白条带。用安马西亚-ECLPrime蛋白印迹检测试剂盒宾夕法尼亚州匹兹堡，GE医疗生命科学进行条带可视化。2.结果重组VSV-NDV载体图1在肿瘤细胞、以及在健康肝细胞和神经元中的复制和细胞毒性已经在体外作出了表征。我们用两株人源肝细胞癌HCC细胞系作为代表性的肿瘤细胞，比较rVSV-NDV与rVSV和rNDV的相对复制和杀伤能力。虽然rVSV-NDV复制比野生型载体稍微延迟，但在感染后约72小时能够达到类似的滴度，引起了体外的完全细胞杀伤图2。为了观察病毒诱导的合胞体形成，附加的细胞被rVSV-NDV以及亲本rVSV和rNDV感染，用于显微镜观察。肿瘤细胞显微分析显示感染rVSV-NDV后16小时孔内有多处合胞体病灶，而感染rNDV的孔内合胞体病灶明显延迟。正如所预期的，用rVSV处理的细胞不形成合胞体；然而，它们对细胞病变效应CPE高度易感，这是VSV感染的典型，且早于感染后16小时之前发生图3。为了排除糖蛋白交换无意中导致的载体对I型干扰素IFN抗病毒作用的敏感性的丧失，进行了IFN剂量反应。VSV对I型IFN的高度敏感性是肿瘤特异性的关键机制，因为肿瘤细胞在其IFN信号通路中经常存在缺陷，而健康细胞可以通过IFN应答基因有效地清除病毒。虽然这种检测显示rNDV对I型IFN相对不敏感，但rVSV-NDV载体通过添加IFN而迅速减弱，并降低到与rVSV观察到的水平相似的水平图4。接下来，我们对正常人源肝细胞和小鼠神经元进行生长曲线和细胞毒性测定，以评估rVSV-NDV的安全性。随着时间推移，假型载体的复制非常少，在感染后48小时，滴度比对照VSV载体低约5个对数，同时在原代肝细胞中，滴度比rNDV低3个对数图5。尽管几乎所有的肝细胞在感染rVSV后72小时死亡，但是通过LDH检测在感染rVSV-NDV的细胞中没有观察到细胞毒性图5。类似地，rVSV-NDV滴度在所调查的所有时间点均显著低于原代小鼠神经元中的对照VSV载体，这与PBS处理神经元中观察到的细胞存活率相似图6。综上所述，rVSV-NDV在原代健康细胞中几乎没有复制的证据，在体外几乎没有或没有细胞毒性，表明它是一种比rVSV和rNDV都安全的病毒。为了确定假型rVSV载体是否如rNDV通过合胞体形成所显示的会诱导免疫原性细胞死亡，我们研究了从感染的Huh7细胞中释放的高迁移率族蛋白1HMGB1和热休克蛋白70和90。感染48小时后，我们观察到释放到rVSV感染细胞的上清中相对低水平的HMGB1、Hsp70和Hsp90。然而，同时感染rNDV和rVSV-NDV导致了高水平的免疫原性细胞死亡的所有三个分泌标记物图7。这些结果表明，除了由感染假型rVSV-NDV载体引起的强有力的直接细胞毒性外，用该病毒进行体内治疗可直接导致针对肿瘤的大量的免疫应答。为了评估假型rVSV-NDV载体在体内的安全性，通过尾静脉注射rVSV-NDV或rVSV-GFP对照病毒N＝6治疗约8周大的免疫缺陷雄性NOD-SCID小鼠，剂量为每只小鼠106TCID50。每天监测小鼠的体重和总体体貌，并在人道终点进行安乐死。在第1、3、7、14天和安乐死时对血液进行取样，以分析血清化学和循环病毒滴度。接受rVSV-GFP的两只小鼠在治疗后的第一周内迅速开始体重减轻，所有六只小鼠在治疗后第11和17天之间都由于极端的体重减轻、脱水、窘迫症状姿势改变、运动障碍、隔离等和或神经毒性征兆肢体麻痹和转圈而急性死亡或被安乐死图8。此外，感染病毒滴度可以在治疗后第1和7天从血液中恢复图8，中间。相比之下，接受rVSV-NDV治疗的小鼠体重仅减轻了可忽略的量，在整个研究中显得健康并表现出正常的行为。其中3只小鼠在治疗后21天安乐死，用于主要器官的组织学分析，而其余的动物在治疗后监测了60天，之后安乐死用于病理分析。在任何分析的时间点，rVSV-NDV治疗的小鼠血液中均未检测到感染性病毒滴度。肝功能GPT和肾功能BUN和肌酐的血浆测量显示两组均无异常值数据未显示。组织切片由对治疗组标本盲化的病理学家进行检查。组织学分析显示，rVSV-NDV治疗的小鼠中，无论是在第21天还是第60天安乐死的，切除的组织中均没有主要病理学结果。此外，在用rVSV-NDV治疗的小鼠中，在脑或肝组织中没有观察到可检测的滴度数据未显示。与此形成鲜明对比的是，接受相同剂量的rVSV-GFP的小鼠表现出严重的窦内水肿、中度急性肝炎伴单细胞和小组织坏死，以及肝组织的凋亡图9。此外，可以观察到脑干急性坏死，变性胶质细胞显示固缩和核分裂。caspase-3免疫组化染色进一步证实胶质细胞的退化。尸检时组织裂解物的TCID50分析显示了在肝脏和脑中可量化水平的感染性VSV。上述说明、权利要求和或附图中公开的特征可以单独地或以其任何组合作为以各种形式实现本发明的材料。参考文献Altomonte，J.，L.Wu，etal.2008.″Exponentialenhancementofoncolyticvesicularstomatitisviruspotencybyvector-mediatedsuppressionofinflammatoryresponsesinvivo.″MolTher161：146-153.Altomonte，J.，S.Marozin，etal.2010.″Engineerednewcastlediseasevirusasanimprovedoncolyticagentagainsthepatocellularcarcinoma.″MolTher182：275-284.Ayala-Breton，C.，G.N.Barber，etal.2012.″Retargetingvesicularstomatitisvirususingmeaslesvirusenvelopeglycoproteins.″HumGeneTher235：484-491.Bull，C.，M.A.Stoel，etal.2014.″Sialicacidssweetenatumor′slife.″CancerRes7412：3199-3204.Coffey，M.C.，Strong，J.E.，Forsyth，P.A.，Lee，P.W.1998.″ReovirustherapyoftumorswithactivatedRaspathway.″Science282：1332-1334.Cuadrado-Castano，S.，M.T.Sanchez-Aparicio，etal.2015.″Thetherapeuticeffectofdeath：Newcastlediseasevirusanditsantitumorpotential.″VirusRes209：56-66.Ebert，O.，K.Shinozaki，etal.2004.“Syncytiainductionenhancestheoncolyticpotentialofvesicularstomatitisvirusinvirotherapyforcancer.”CancerRes649：3265-70.Ebert，O.，S.Harbaran，etal.2005.″Systemictherapyofexperimentalbreastcancermetastasesbymutantvesicularstomatitisvirusinimmune-competentmice.″CancerGeneTher124：350-358.Edge，R.E.，T.J.Falls，etal.2008.″Alet-7MicroRNA-sensitivevesicularstomatitisVirusdemonstratestumor-specificreplication.″MolTher168：1437-1443.Everts，B.andH.G.vanderPoel2005.″Replication-selectiveoncolyticvirusesinthetreatmentofcancer.″CancerGeneTher122:141-161.HuangH.G.，O.Ebert，etal.2003.“Oncolysisofhepaticmetastasisofcolorectalcancerbyrecombinantvesicularstomatitisvirusinimmunecompetentmice.”MolTher83:434-40.Johnson，J.E.，F.Nasar，etal.2007.″Neurovirulencepropertiesofrecombinantvesicularstomatitisvirusvectorsinnon-humanprimates.″Virology3601:36-49.Kelly，E.J.，R.Nace，etal.2010.″AttenuationofvesicularstomatitisvirusencephalitisthroughmicroRNAtargeting.″JVirol843:1550-1562.Kirn，D.，Martuza，R.L.，andZwiebel，J.2001.″Replication-selectivevirotherapyforcancer:biologicalprinciples，riskmanagement，andfuturedirections.″NatMed7:781-787.Lawson，N.D.，E.A.Stillman，etal.1995.“RecombinantvesicularstomatitisvirusesfromDNA.”ProcNatlAcadSci92:4477-81.Liu，Y.P.，S.P.Russell，etal.2014.″Ablationofnectin4bindingcompromisesCD46usagebyahybridvesicularstomatitisvirusmeaslesvirus.″JVirol884:2195-2204.Lorence，R.M.，Katubig，B.B.，Reichard，K.W.，etal1994.″CompleteregressionofhumanfibrosarcomaxenograftsafterlocalNewcastlediseasevirustherapy.″CancerResearch54:6017-6021.Muik，A.，I.Kneiske，etal.2011.″Pseudotypingvesicularstomatitisviruswithlymphocyticchoriomeningitisvirusglycoproteinsenhancesinfectivityforgliomacellsandminimizesneurotropism.″JVirol8511:5679-5684.Patel，M.R.andR.A.Kratzke2013.″Oncolyticvirustherapyforcancer:thefirstwaveoftranslationalclinicaltrials.″TranslRes1614:355-364.Park，M.S.，Steel，J.，Garcia-Sastre，A.，etal2006.“Engineeredviralvaccineconstructswithdualspecificity:AvianinfluenzaandNewcastledisease.”PNAS10321:8203-8.Peeters，B.P.，O.S.deLeeuw，etal.1999.“RescueofNewcastlediseasevirusfromclonedcDNA:evidencethatcleavabilityofthefusionproteinisamajordeterminentofvirulence.”JVirol736:5001-9.Peng，K.W.，Ahmann，G.J.，Pham，L，etal2001.″Systemictherapyofmyelomaxenograftsbyanattenuatedmeaslesvirus.″Blood98:2002-2007.Quiroz，E.，N.Moreno，etal.1988.″AhumancaseofencephalitisassociatedwithvesicularstomatitisvirusIndianaserotypeinfection.″AmJTropMedHyg393:312-314.Stojdl，D.F.，Lichty，B.D.，tenOever，B.R.，etal2003.″VSVstrainswithdefectsintheirabilitytoshutdowninnateimmunityarepotentsystemicanti-canceragents.″CancerCell44:263-275.vandenPol，A.，Dalton，K.，andRose，J.2002.″Relativeneurotropismofarecombinantrhabdovirusexpressingagreenfluorescentenvelopeglycoprotein.″JournalofVirology763:1309-1327.Vigil，A.，M.S.Park，etal.2007.″UseofreversegeneticstoenhancetheoncolyticpropertiesofNewcastlediseasevirus.″CancerRes6717:8285-8292.

权利要求：1.一种重组溶瘤病毒，包含水疱性口炎病毒VSV，其中VSV糖蛋白G蛋白缺失，并且所述水疱性口炎病毒VSV包含新城疫病毒NDV的修饰融合蛋白F蛋白；以及NDV的血凝素神经氨酸酶HN蛋白。2.如权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述NDV的修饰融合蛋白F蛋白是F3aa修饰的F蛋白，和或在蛋白酶剪切位点包含至少一个氨基酸取代，优选地，在位置L289，例如L289A，和或其中VSV的G蛋白被修饰的融合蛋白和NDV的HN蛋白所取代。3.如权利要求1或2所述的重组溶瘤病毒，其中所述NDV的修饰融合蛋白F蛋白包含或由下列组成：SEQIDNO.10或SEQIDNO.12的氨基酸序列，或由与SEQIDNO.10或12的氨基酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的氨基酸序列，和或其中NDV的修饰融合蛋白F蛋白由SEQIDNO.9或SEQIDNO.11的核苷酸序列编码，或由与SEQIDNO.9或11的核苷酸序列有至少60％，或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列编码；和或其中所述NDV的HN蛋白包含或由下列组成：SEQIDNO.6的氨基酸序列，或与SEQIDNO.6的氨基酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的氨基酸序列，和或其中所述NDV的HN蛋白由SEQIDNO.5的核苷酸序列或与SEQIDNO.5的核苷酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列编码。4.如编码权利要求1至3任一项所述的重组溶瘤病毒的核苷酸。5.包含如权利要求4所述的核苷酸的载体，可选地进一步包含-报告基因，诸如HSV1-sr39TK、钠碘转运体NIS、生长抑素受体2SSTR2、荧光素酶萤火虫或海肾、绿色荧光蛋白GFP、lacZ、酪氨酸酶，-被递送到靶细胞或组织的基因，诸如被递送到肿瘤细胞或肿瘤的基因，例如，免疫刺激基因，诸如IFN-α、IFN-β或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF；免疫检查点抑制抗体，诸如PD-1、PD1-L、CTLA-4、LAG-3或B7-H3；和或用于疫苗接种的肿瘤相关抗原TAA肿瘤特异性靶向；-或其组合。6.如权利要求4所述的核苷酸或如权利要求5所述的载体，包含或由下列组成：SEQIDNO.13的核苷酸序列，或与SEQIDNO.13的核苷酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列，和或包含或由下列组成：编码SEQIDNO.6、12、14至17的氨基酸序列的核苷酸序列，或与编码SEQIDNO.6、12、14至17的氨基酸序列的核苷酸序列有至少60％或优选的至少70％或80％或90％或95％序列同一性的核苷酸序列。7.一种药物组合物，包含i如权利要求1至3任一项所述的重组溶瘤病毒或如权利要求4至6任一项所述的核苷酸或载体；和ii可选地，药学上可接受的载体和或赋形剂。8.如权利要求7所述的药物组合物，还包含药物，诸如化学治疗剂、放射治疗剂、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、细胞载体系统、小分子抑制剂、栓塞剂、屏蔽聚合物。9.如权利要求7或8所述的药物组合物，配制用于全身递送、肿瘤注射、静脉内施用、动脉内施用、和或用于皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹腔内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射。10.如权利要求1至3任一项所述的重组溶瘤病毒或权利要求4至6任一项所述的核苷酸或载体或权利要求7至9任一项所述的药物组合物，作为基因递送工具、非侵入性病毒的生物分布成像，和或肿瘤检测中的用途。11.如权利要求1至3任一项所述的重组溶瘤病毒或权利要求4至6任一项所述的核苷酸或载体或权利要求7至9任一项所述的药物组合物，以用于医学。12.如权利要求1至3任一项所述的重组溶瘤病毒或权利要求4至6任一项所述的核苷酸或载体或权利要求7至9任一项所述的药物组合物以用于肿瘤的诊断、预防和或治疗。13.如权利要求12所述的重组溶瘤病毒、核苷酸、载体或药物组合物，以用于溶瘤治疗。14.如权利要求12所述的重组溶瘤病毒、核苷酸、载体或药物组合物，以与其他疗法联合使用，诸如细胞载体系统，例如T细胞、树突状细胞、NK细胞、间充质干细胞，免疫疗法，例如肿瘤疫苗或免疫检查点抑制剂，和或标准肿瘤疗法，例如射频消融、化疗、栓塞、小分子抑制剂，和或其中施用是通过全身，静脉内注射，动脉内注射，通过注入肿瘤，和或通过皮内、皮下、肌内、静脉、骨内、腹膜内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射。15.一种诊断、预防和或治疗癌症的方法，包括步骤：向有需要的受试者施用治疗量的如权利要求1至3任一项所述的重组溶瘤病毒或权利要求4至6任一项所述的核酸或载体或权利要求7至9任一项所述的药物组合物，其中优选施用是通过全身、静脉内、动脉内、注射入肿瘤，和或通过皮内、皮下、肌内、静脉、骨内、腹膜内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内、脑内、脑室内和玻璃体内注射。

百度查询： 慕尼黑工业大学附属伊萨右岸医院 用于肿瘤溶瘤治疗的VSV/NDV杂合病毒