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摘要：本发明旨在解决草鱼柱状黄杆菌弱毒活疫苗保护率不高，弱毒株来源不稳定等问题，提供了一种弱毒株来源稳定可靠、疫苗保护率较高的一种草鱼柱状黄杆菌弱毒活疫苗。草鱼柱状黄杆菌弱毒活疫苗的制备方法的步骤包括野生型菌株的复苏、柱状黄杆菌利福平抗性菌株的制备、细菌毒力测定、浸泡免疫保护效果等步骤。

主权项：1.一种草鱼柱状黄杆菌弱毒活疫苗的制备方法，其步骤在于：一.野生型菌株的复苏1将保存在-80℃冰箱中的柱状黄杆菌株MU-04取出，在超净工作台里，用一次性接种环蘸取少量柱状黄杆菌冻融块，溶于100μLShieh液体培养基中；溶解混合均匀后，用一次性接种环蘸取少量菌液在Shieh培养基上呈“Z”字型进行平板划线，并在盖子上注明实验时间和菌株名字；2用封口膜封口后，将培养皿放置于28℃恒温培养箱中，倒置培养48h；3用移液枪吸取400μLShieh液体培养基到EP管中，再从平板上挑取单菌落接种于液体培养基中吹打混匀，取200μL菌液到含有Shieh液体培养基的锥形瓶中，并在28℃、150rpm摇床上振荡培养24h；二.柱状黄杆菌利福平抗性菌株的制备1用移液枪从上述培养菌液中吸取200μL，转接到新的Shieh液体培养基里，并加入1μL的利福平溶液，轻轻晃动锥形瓶使利福平混匀，此时培养液中利福平的浓度为1μgmL；2将锥形瓶瓶口放于酒精灯火焰上转动灼烧灭菌后，重新用透气封口膜包好瓶口，并置于28℃、150rpm摇床上振荡培养24h；3重复以上步骤，使菌液中所含利福平浓度按1μgmL、3μgmL、5μgmL、10μgmL、20μgmL、40μgmL、80μgmL、160μgmL、200μgmL依次递增，最后在含有200μgmL利福平的培养液中连续传20代，获得抗利福平的柱状黄杆菌，命名为MU-04F20；三.细菌毒力测定分别用野生型菌株MU-04和利福平抗性菌株MU-04F20对草鱼进行浸泡攻毒，在攻毒前草鱼全部健康存活，随机分组，每组100条；将菌液振荡培养24h，通过菌落梯度稀释与涂布平板计数法使菌液浓度被控制在同等水平上，对草鱼进行浸泡攻毒，持续1h后将草鱼转移至干净养殖水体中，持续观察一周，记录草鱼发病死亡情况；结果显示野生型菌株、利福平抗性菌株攻毒组草鱼存活率分别为47％、90％，利福平抗性菌株的毒力相较于原菌株显著降低；四.浸泡免疫保护效果1市场买回一批规格大小相同的约3～4cm的草鱼，先在实验室循环养殖系统中养殖一段时间，以适应实验环境；2将草鱼取出分放于装有450mL水的小箱中，随机分为2组，每组100条鱼，并做好标记，放置于28℃气候箱中养殖1周；3将菌液按浓度梯度进行稀释，稀释倍数约为30～50倍；经稀释和菌落计数，得到浓度为1.6×107CFUmL的MU-04F20菌液；4首次免疫：取50mL的MU-04F20，倒入做好标记的小箱子中，浸泡免疫1h；待免疫完成后，将草鱼重新置于干净水体中，28℃养殖14d；剩下的一组为空白对照组，加入等量的Shieh培养基；5二次免疫：将经过首次免疫后的草鱼捞出放于盛有450mL养殖水的小箱子中，加入50mLMU-04F20进行浸泡免疫1h，空白对照组加入等量的Shieh培养基；同样条件进行养殖；6保护率：于首次免疫后的第4周，对草鱼进行MU-04野生型菌株浸泡攻毒1h，养殖期间注意观察记录鱼体病症情况和死亡数目；结果显示经两轮浸泡免疫后，利福平抗性菌株MU-04F20免疫组能给予草鱼相对免疫保护率为10％。

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百度查询： 华南农业大学 一种草鱼柱状黄杆菌弱毒活疫苗的制备方法