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摘要：本发明涉及医用、牙科用或梳妆用的配制品技术领域，尤其涉及一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法。本发明中的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂系由高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂（rhIL‑1Ra）蛋白的大肠杆菌细胞，经发酵培养，分离和高度纯化后制成的水针剂，含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。

主权项：1.一种重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将高效表达人白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白的大肠杆菌的工作种子批菌种接种于500~600mL一级种子培养基中，分为2批，在30~35℃，100~250rpm下培养5~10h，OD600为0.5~1.5时即为一级种子液；在30℃，100~250rpm，通气量24Lmin下调节罐压为0.02~0.05MPa，向二级种子培养基中补加硫酸镁溶液、葡萄糖溶液、微量元素溶液、硫酸亚铁溶液，接种一级种子液，培养4~6h，OD600为0.5~1.5时即为二级种子液；S2、将全部种子液接种在灭菌培养基中，发酵培养温度为30±1℃，pH设置为7.0±0.05，在发酵过程中保持发酵液中溶解氧饱和度≥30%，并根据葡萄糖消耗情况进行补料操作，待OD600值达到80~120时，停止补料，加入IPTG溶液进行诱导，诱导结束后继续发酵培养，同时进行补料操作，培养8~10h后终止发酵；S3、离心收集菌体，﹣20℃下冻存，对菌体进行初步纯化后将收集的菌体按1：9的重量比用菌体重悬缓冲液悬起，以30~60rpm转速搅拌1~2h，调节pH至5.5±0.05，在＜10℃下，640~680bar均质1次，800~900bar均质1~2次后再次调节pH至5.5±0.05，离心收集上清液；过滤澄清，收集滤液即为重组人白细胞介素-1拮抗剂初提液，经柱层析后加入到水中，浓度≥150mgmL，加入1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及聚乙二醇衍生物，室温下搅拌2~4h后经酸洗、碱洗、盐水洗涤后透析2~3d，再置换缓冲液，其中枸橼酸钠2.85gkg，依地酸二钠0.2gkg，氯化钠8.18gkg，无水枸橼酸0.02gkg，pH6.0~7.0，最终浓缩液的蛋白浓度应≥120mgmL，除菌过滤成重组人白细胞介素-1受体拮抗剂原液；S4、将原液用稀释液稀释至所需浓度后加入聚山梨酯80，使重组人白细胞介素-1拮抗剂终浓度为90~110mgmL，枸橼酸钠终浓度为2.85mgmL，依地酸二钠终浓度为0.20mgmL，氯化钠终浓度为8.18mgmL，无水枸橼酸终浓度为0.058mgmL，聚山梨酯80终浓度为1.05mgmL，经除菌过滤，即为半成品，经检定、分批、分装、包装即得；所述聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：X1、将维生素E-醋酸酯加入到乙醇中，再加入0.5molL氢氧化钠水溶液，维生素E-醋酸酯与氢氧化钠的摩尔比为1:1，至pH为7~8后搅拌2~6h，搅拌结束后加入二氯甲烷萃取，合并有机相后加入稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤后浓缩得残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶加入到二氯甲烷中，残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2~3:1~1.5，在氮气气氛下搅拌20~30h，加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，透析2~3d后用于下一步；X2、将上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺加入到二氯甲烷中，在氮气气氛下搅拌20~30h，过滤后与八臂-聚乙二醇-羟基的二氯甲烷溶液混合，上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺、八臂-聚乙二醇-羟基的摩尔比为1:1~1.5:1~1.5:0.1，继续搅拌20~30h后加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，洗涤3次后透析2~3d干燥即得。

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