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摘要：本发明属于绿色化学技术领域，具体涉及一种调控腈类化合物区域选择性的腈水合酶改造方法与应用。所述的构建方法是对位于腈水合酶底物通道和结合口袋的关键氨基酸进行点突变改造，构建腈水合酶突变体纯酶。新构建的腈水合酶突变体纯酶可应用于调控催化腈类化合物反应的区域选择性。与改造前相比，酶催化反应的区域选择性偏向于中间产物5‑氰基戊酰胺，显著抑制了副产物己二酰胺的生成，实现了5‑氰基戊酰胺的富集，对催化反应区域选择性的调控与中间产物的合成研究具有重要的借鉴意义，有利于增强腈水合酶的工业化应用价值。

主权项：1.一种调控腈类化合物区域选择性的腈水合酶改造方法，其特征在于，所述的改造方法是对腈水合酶重组质粒βWT-ReNHase-AC-His的位点Y37，M40以及Y72进行点突变，构建对单酰胺产物具有优异区域选择性的腈水合酶突变体；具体方法如下：以腈水合酶重组质粒βWT-ReNHase-AC-His作为模板，以PstI与SacI作为酶切位点，使用基因搭桥，对目标序列进行PCR扩增，对目标序列和模板质粒进行双酶切后，使用T4连接酶将目标序列连接到βWT-ReNHase-AC-His上，实现突变体Y37P-ReNHase、M40F-ReNHase与Y72A-ReNHase的重组质粒的构建；将上述三种构建完成的重组质粒经由42℃热激转化分别导入ArcticExpressDE3大肠杆菌感受态细胞，过夜培养后挑取单克隆进行培养，随后加入IPTG进行低温诱导培养；结束诱导离心菌液，加入PB缓冲液进行清洗后，重悬菌液并进行超声波破碎，经离心后的上清液过滤膜除去杂质，并使用AKTAPure进行蛋白纯化得到腈水合酶突变体纯酶Y37P-ReNHase、M40F-ReNHase与Y72A-ReNHase；所述的模板腈水合酶βWT-ReNHase-AC-His的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，突变体Y37P-ReNHase的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，突变体M40F-ReNHase的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，突变体Y72A-ReNHase的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

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