买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

摘要：本发明涉及一种单细胞快速测序分析方法，属于基因测序技术领域。本发明先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析。本发明于细胞悬浮液中添加了聚乙烯醇，于带有分子条形码的微珠悬浮液中添加了聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，当二者被泵至同一滴液滴生成油中时，聚乙烯醇、聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮协同增加所生成的微滴的稳定性，有效降低了微滴的破损率，同时聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮还可以提高mRNA富集于PolydT的效率，从而提高样本有效率，避免造成浪费。

主权项：1.一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，包含以下步骤：先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析；所述的微流体装置包含：核心为一块玻璃微流控芯片，其联通四个输入管道及一个输出管道；所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成，其引物的序列包含四个部分：PCRprimer、12bp的CellBarcode、8bp的UMI和30bp的PolydT序列；所述的微滴具体通过以下步骤得到：W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中；在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子，通过磁力搅拌器控制；W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中，四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道，并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mLh，液滴生成油的流速为14mLh；W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况；将微滴收集在离心管中；W4.在微滴生成期间，通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态；所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离步骤或骨髓血PBMC分离步骤得到；所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作：X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液；X2.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用；X3.吸取稀释血液，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；X4.离心，此时离心管中形成4层：第一层为稀释液层，第二层为呈白膜状的单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；X5.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，加5倍体积的PBS缓冲液洗1～2次，每次300ⅹg离心10min；X6.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，控制单个核细胞的浓度为60个μL；所述的骨髓血PBMC分离步骤包含以下操作：Y1.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用；Y2.按体积比5:1取骨髓血加入PBS缓冲液稀释血液，300ⅹg离心5min；然后弃上清，加入3倍体积PBS缓冲液稀释血液，300ⅹg离心10min；Y3.离心完成后弃上清，加入2倍骨髓血体积的PBS缓冲液，重悬，过滤，得到预处理骨髓血；Y4.吸取预处理骨髓血，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使预处理骨髓血重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；Y5.离心，此时离心管中形成5层：最上层是血浆，血浆和淋巴细胞分离液之间是呈白膜状的单个核细胞层；Y6.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，加5倍体积的PBS缓冲液洗1～2次，每次300g离心10min；Y7.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，控制单个核细胞的浓度为60个μL；所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备：将带有分子条形码的微珠先后用100％乙醇洗两次和TETW洗两次，1000ⅹg离心1min，然后弃上清，再用TETW重悬，用100μm过滤器过滤，放入离心管中，加入的DropSeqlysisbuffer洗涤，1000ⅹg离心1min，弃上清；然后重新悬浮在含有1mMDLB缓冲液和50mMDTT的混合液中，并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子μL；所述TETW包含10mMTrispH8.0、1mMEDTA及0.01％Tween；所述的DropSeqlysisbuffer包含1mMDLB缓冲液、200mMTrispH7.5、6％FicollPM-400、0.2％Sarkosyl及20mMEDTA。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 广州君瑞康医学检验实验室有限公司 一种单细胞快速测序分析方法