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申请/专利权人：深圳大学
摘要：本发明公开了一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其包括步骤：提取待测样品中的RNA；使用polyA加尾酶和MMLV逆转录酶，结合带有polyT的逆转录引物对所述RNA进行加尾和逆转录，得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链；利用外切酶I清除反应体系产物中剩余的逆转录引物；对所述cDNA第一链进行变性后与末端突出的双链DNA接头进行连接，得到连接产物；对所述连接产物用USER酶处理，得到处理后cDNA；对处理后cDNA进行PCR扩增，得到高通量测序文库。本发明实现了对血浆中极其微量的smallRNA的文库构建，本发明不依赖于RNA5’端为磷酸化修饰，因而可以对更多不同类型的RNA进行文库构建。
主权项：1.一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法，其特征在于，包括步骤：提取待测样品中的RNA，备用；将待测样品中的RNA和结合带有polyT的逆转录引物混合，制备成混合样品后置于70℃孵育2min后立即放置于冰上，备用；将PolyA加尾缓冲液、逆转录缓冲液、PolyA加尾酶、MMLV逆转录酶混合在一起，得到反应液；将反应液与放置于冰上的混合样品混匀后置于37℃孵育30min后得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cDNA第一链；将外切酶I加入到反应体系产物中，在37℃保温30min，接着以80℃保温20min，清除反应体系产物中的逆转录引物；对所述cDNA第一链进行95℃5min孵育使其变性，得到变性cDNA第一链；使用末端突出的双链DNA接头与变性cDNA第一链在20℃保温1h，接着在65℃保温15min的条件下进行连接，得到连接产物；利用USER酶对所述连接产物进行37℃15min处理，得到处理后cDNA；对处理后cDNA进行PCR扩增，得到高通量测序文库；所述带有polyT的逆转录引物包含8bp的样本标识碱基；所述末端突出的双链DNA接头，末端突出的为6个兼并碱基。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 深圳大学 一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法
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