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申请/专利权人：山东中医药大学

摘要：本发明公开了一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法。本发明采用CRISPRCas9技术构建了斑马鱼apoeb基因突变模型，构建能够稳定遗传的apoeb‑‑Tgmpeg1:EGFP、apoeb‑‑Tglyzc:dsRed、apoeb‑‑Tggata1a:mCherry、apoeb‑‑Tgflk1:EGFP多品系斑马鱼，搭建一个简便、高效、快速的从多病理角度评价AS的药物筛选平台，此平台可用于对抗AS药物进行高效筛选，以期发现具有潜在治疗价值的药物。

主权项：1.一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：Setp1利用CRISPRCas9技术构建apoeb基因突变斑马鱼模型；Setp1.1设计apoeb基因gRNA，位点由在DNA正义链或反义链中寻找GGN18NGG序列确定；Setp1.2将gRNA与Cas9蛋白混匀，共同显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中，利用CRISPRCas9系统对apoeb基因进行大片段敲除；Setp1.3apoeb--斑马鱼显微注射后12周龄时，剪下尾鳍，提取DNA进行鉴定，确定F0斑马鱼基因敲除成功；Setp1.4将基因敲除成功F0斑马鱼回交，产卵后收集48hpf胚胎20枚，提取DNA行基因组测序；余F1斑马鱼饲养至成鱼12周龄时，剪下尾鳍，提取DNA进行鉴定及测序，确定F1斑马鱼基因敲除成功，后续进行回交传代；Setp2基于多品系apoeb基因突变斑马鱼模型构建抗AS药物筛选平台；Setp2.1杂交获取多品系apoeb基因突变斑马鱼；Setp2.2将斑马鱼分为4组，分别处理；Ctrl组不予喂食；ND+Ctrl组给予普通饲料喂食；Ctrl+HFD组给予高脂饲料；apoeb--+HFD组给予高脂饲料喂食；Setp2.3指标检测，油红O染色观察血管壁脂质沉积、斑块形成及体内脂肪积累等病理改变，全组织匀浆液生化学指标检测，观察血流速度，观察血管内皮细胞损伤程度Setp3基于apoeb--斑马鱼AS模型评价瑞舒伐他汀抗AS疗效；Setp3.1斑马鱼分为2组，给与不同处理；Model组apoeb--AB斑马鱼给予高脂饲料喂食；Model+Statin组apoeb--AB斑马鱼高脂饲料喂食后给予0.4ugml瑞舒伐他汀24h药浴；Setp3.2指标检测同Setp2.3。

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