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申请/专利权人：南京农业大学三亚研究院;南京农业大学

摘要：本发明涉及冠状病毒弱毒疫苗开发技术领域，具体涉及一种禽传染性支气管炎病毒弱毒株的制备及其应用。本发明首先采用TAR克隆技术建立了QX‑IBV反向遗传操作系统，随后通过密码子对去优化重新编码了病毒的部分基因组，得到了禽传染性支气管炎病毒弱毒株rQX‑CPDF7。本发明经过对1日龄SPF雏鸡的致病性分析发现，经过密码子对去优化的毒株极大降低了病毒的致病性，并且能够为强毒株的攻击提供有效的免疫保护。为禽传染性支气管炎病毒弱毒疫苗的开发提供了一种切实可行的方案，同时为禽传染性支气管炎病毒的致病机理的研究提供了参考。

主权项：1.一种QX型禽传染性支气管炎病毒弱毒株的感染性克隆，其特征在于，所述感染性克隆通过如下步骤构建：步骤1，以含有QX型禽传染性支气管炎病毒的cDNA为模板，通过PCR扩增获得所述QX型禽传染性支气管炎病毒的全基因组分段序列CMV-QXF1、QXF2、QXF3、QXF4、QXF5、QXF6、QXF7、QXF8、QXF9和QXF10-HB；步骤2，以鸡传染性支气管炎疫苗株H120为模板，通过密码子对去优化对基因组部分序列进行重新编码，再通过PCR扩增出CPDF7序列，使用CPDF7序列替换QXF7序列，再经过TAR克隆即可获得禽传染性支气管炎病毒弱毒株的感染性克隆；其中，步骤1中，扩增分段序列CMV-QXF1、QXF2、QXF3、QXF4、QXF5、QXF6、QXF7、QXF8、QXF9和QXF10-HB所用引物如SEQIDNO：21~46所示；其中，CMV-QXF1是将CMV序列和QXF1序列采用CMV-FCMV-R和QXF1-FQXF1-R两对引物通过Overlap-PCR扩增获得，所述CMV-FCMV-R引物如SEQIDNo：21~22所示，所述QXF1-FQXF1-R引物如SEQIDNo：23~24所示；QXF10-HB是使用QXF10序列和HB序列采用QXF10-FQXF10-R和HB-FHB-R两对引物通过Overlap-PCR扩增获得，所述QXF10-FQXF10-R引物如SEQIDNo：41~42所示，所述HB-FHB-R引物如SEQIDNo：43~44所示；QXF9通过F9-FF9-R引入沉默突变T23776C作为遗传标记，所述F9-FF9-R引物如SEQIDNo：39~40所示；步骤2中，将CMV-QXF1、QXF2、QXF3、QXF4、QXF5、QXF6、CPDF7、QXF8、QXF9和QXF10-HB、线性pYES1L载体转化MaV203酵母细胞，3天后经过PCR筛选阳性菌落，并将阳性菌落电转化至E.coliTOP10感受态细胞，扩大培养，并使用质粒提取试剂盒提取重组质粒得到pYES1L-rQX-CPDF7；所述CPDF7序列如SEQIDNO：47所示；所述QX型禽传染性支气管炎病毒的全基因组序列的GenBank登录号为：PP438800。

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