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申请/专利权人：遵义医科大学

摘要：本发明涉及一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，属于生物分析检测技术领域。该方法利用磷酸化的抗坏血酸可以被碱性磷酸酶水解成抗坏血酸还原铜离子，催化点击化学反应的发生从而连接DNA短片段，因其连接前后在氧化石墨烯作用下荧光强度有明显变化，构建了一种新型检测碱性磷酸酶的荧光方法。本方法在0～1UmL范围内有很好的线性响应，检测限为0.0036UmL。本申请具有高特异性、稳定性好、成本低、操作简单等特点。

主权项：1.一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将测试样品分别与2-磷酸-抗坏血酸（AAP）混合，置于水浴中充分反应；步骤二：将修饰了叠氮基团且短的单链核酸、修饰了炔基基团且短的单链核酸和作为连接模板且修饰了荧光基团的核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液；步骤三：将步骤二配制的三种核酸溶液混合，配制成核酸混合溶液，然后向核酸混合溶液中加入步骤一反应好的测试样品与AAP的反应液、铜离子和Tris-HCl缓冲溶液，形成反应体系；步骤四：向步骤三的反应体系中加入纯水、氧化石墨烯、Tris-HCl缓冲溶液，升温后对检测体系的荧光强度进行检测；步骤五：以已知碱性磷酸酶浓度的样品和对应的荧光强度值所建立的标准曲线，来检测未知碱性磷酸酶浓度的待测样品，待测样品按照步骤一至步骤四操作得到荧光强度，计算得到其中含有碱性磷酸酶的浓度；所述作为连接模板且修饰了荧光基团的核酸具体为以下的一种或多种核苷酸序列结构：5’-FAM-ATTCTATCAGTTTCTTGGAATTTAGCGA-3’、5’-CATATATGTTGCCACTCTAGCGGCCGTGG-TAMRA-3’、5’-FAM-CCGTGCCGTGTCTTGTAGTTCCCGTCGAATCG-3’、5’-TAMRA-CCTCTACGTGTCTTGTACTTCGGATCAGAGAGG-3’；修饰了叠氮基团且短的单链核酸为5’-GATCTAAATTCCAA-叠氮-3’或5’-叠氮-TGGCAACAGC-3’或5’-GACGGGAACT-叠氮-3’或5’-叠氮-TACAAGACACGG-3’所示的核苷酸序列；所述的修饰了炔基基团且短的单链核酸为5’-炔基-CAAACTGATAG-3’或5’-GGGAGCTAGAG-炔基-3’或5’-炔基-ACAAGACACG-3’或5’-CTGACGGGAAG-炔基-3’所示的核苷酸序列。

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